【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法及其载体文库。本专利申请为2021年7月6日提交的韩国专利申请第10-2021-0088575号要求优先权，并且所述专利申请的公开内容通过引用并入本文。
技术介绍
1、呼肠孤病毒科(reoviridae)病毒为以双链rna为基因组的病毒家族之一，其基因组片段包装在多层衣壳内，不包括含脂质的外壳，具有尺寸约为70nm至85nm的多面体形状。所述呼肠孤病毒科分为光滑呼肠孤病毒(sedoreovirinae)和刺突呼肠孤病毒(spinareovirinae)亚科，其感染主要影响消化或呼吸器官。轮状病毒(human rotavirus，hrv)是引起婴幼儿腹泻的主要病毒，据了解，韩国及世界各地95％的5岁以下儿童至少感染过一次，约占全球每年发生的腹泻病例的40％。轮状病毒感染症由轮状病毒显性感染所致，主要传播途径为粪-口感染，潜伏期约为24小时至72小时。这种疾病会引起呕吐、发烧和血性水样腹泻，从而导致脱水，主要发生于婴幼儿或儿童，但偶尔在老年病房发生群体性暴发。
2、轮状病毒具有由11个dsrna片段组成的基因组，无包膜，呈正二十面体，直径约为75nm，由外衣壳、内衣壳、核心蛋白三层蛋白衣壳组成。每个片段编码六个结构蛋白(vp1、vp2、vp3、vp4、vp6和vp7)和五个非结构蛋白中的任一个。所述轮状病毒分为a组至h组8个类型，a、b、c组感染在人类中常见，尤其是a组感染。所述a组轮状病毒根据vp4和vp7蛋白分为p或g血清型(serotype)，具体地，蛋白酶敏感性蛋白
3、由于轮状病毒不提供血清型间交叉保护的特性，因此需要开发能够预防各血清型感染的有效轮状病毒疫苗。目前为止，已使用口服减毒活疫苗和动物-人重组疫苗，但对其他血清型的感染没有表现出足够的保护能力，美国wyeth-ayerst公司开发的rotashield为一种与发病率最高的g血清型(g1-g4)混合的四价减毒活疫苗，获得fda批准并纳入基本疫苗接种，但由于出现肠道重叠患者而停止使用。因此，作为针对轮状病毒感染的疫苗材料，对天然/人工产生/制备的重配轮状病毒(包括病毒样颗粒)的兴趣正在增加。
4、另一方面，重配轮状病毒(reassortant rotavirus)为当单个细胞同时感染多种病毒株(strain)时，不同病毒株的rna片段组合而成的病毒，可以自然界中自发产生，但其出现的概率很低，即使发生重配，也很难分离出来，因为与野生型病毒相比，其减毒程度非常高。另外，也可以通过用牛(bovine)轮状病毒和人(human)轮状病毒同时感染单个人工培养细胞的方式产生重配轮状病毒，但这与亚型病毒相比，所产生的量也非常少，并且被减毒，若不施加选择压力(selective pressure)，则随着传代的进行，其比例逐渐降低，从而存在分离和回收所需的重配轮状病毒非常困难的缺点。为了解决这些问题，正在引入使用对待替换基因的蛋白质具有特异性中和抗体来筛选重配轮状病毒的额外过程，但存在技术限制，因为应该提前解决确保具有所述功能的单克隆中和抗体的问题，并且需要针对每种血清型进行单独的筛选过程。
5、在此技术背景下，作为开发针对包括轮状病毒在内的呼肠孤病毒科病毒的疫苗的一部分，正在进行各种研究以有效地制备重配病毒(韩国专利公开第10-2019-0108882号)，但仍存在不足。
技术实现思路
1、技术问题
2、本专利技术的一方面提供一种重配呼肠孤病毒科(reoviridae)病毒的制备方法，其使用已引入rna聚合酶基因的细胞系和根据一方面的轮状病毒表达载体文库。
3、本专利技术的另一方面提供一种通过所述方法制备的重配呼肠孤病毒科病毒及包括其的免疫原性组合物。
4、本专利技术的又一方面提供一种用于制备重配轮状病毒的表达载体文库。
5、下面，结合所附权利要求书和附图进行详细说明，以使本申请的其他目的和优点更加清楚。对于本说明书中未记载的内容，本申请所属领域或相似
的技术人员可以充分认识和推断，因此不再赘述。
6、技术方案
7、本专利技术的一方面提供一种重配呼肠孤病毒科(reoviridae)病毒的制备方法，其包括：用含有外源基因的表达载体文库转染已引入rna聚合酶(rna polymerase)基因的第一细胞系；将所述转染的第一细胞系在生长培养基中培养以形成第一培养物；通过将第二细胞系添加到所述培养的第一培养物中来培养第二培养物；和通过向所述培养的第二培养物中添加胰蛋白酶来培养第三培养物，其中，所述表达载体文库包括呼肠孤病毒科病毒基因片段cdna和可与所述rna聚合酶结合的启动子。
8、本文所用的术语，“呼肠孤病毒科(reoviridae)”病毒为以双链rna为基因组的病毒家族之一，其基因组片段包装在多层衣壳内，不包括含脂质的外壳，具有尺寸约为70nm至85nm的多面体形状。所述呼肠孤病毒科病毒例如可以选自轮状病毒(rotavirus)属、卡多呼肠孤病毒(cardoreovirus)属、米莫呼肠孤病毒(mimoreovirus)属、环状病毒(orbivirus)属、植物呼肠弧病毒(phytoreovirus)属、东南亚十二节段rna病毒(seadornavirus)属、水产呼肠孤病毒(aquareovirus)属、科罗拉多壁蝨热病毒(coltivirus)属、质型多角体病毒(cypovirus)属、迪诺维纳病毒(dinovernavirus)属、斐济病毒(fijivirus)属、昆虫非包涵体病毒(idnoreovirus)属、真菌呼肠孤病毒(mycoreovirus)属、正呼肠孤病毒(orthoreovirus)属和水稻病毒(oryzavirus)属中的任一病毒，例如可以为轮状病毒属、呼肠孤病毒属、环状病毒属或科罗拉多壁蝨热病毒属的病毒，例如可以为轮状病毒。
9、所述呼肠孤病毒科病毒在细胞质繁殖并随着细胞破坏而释放，引起人类、鱼类、昆虫和植物等多种宿主的感染，在这些病毒中，已知轮状病毒属、呼肠孤病毒属、环状病毒属或科罗拉多壁蝨热病毒属的病毒会影响人类。相应地，正在进行各种研究来制备用于预防呼肠孤病毒科病毒感染的疫苗组合物，特别是活疫苗，但由于双链rna基因组分为多个片段的遗传特征以及各种血清型的存在，存在困难。另一方面，由于rna本身的不稳定性以及由此导致的细胞内递送的困难，通过将每个合成的病毒(viral)rna片段直接递送至细胞来制备的现有方法难以应用于由多个基因片段组成的呼肠孤病毒科病毒的制备。另外，通过质粒dna的制备方法利用宿主细胞的转录和rna修饰机制，其问题在于，由于额外的引入细胞核的输入过程导致递送效率降低，以及由于宿主细胞内存在有限量的聚合酶而引起启动子之间的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法，其包括：用含有外源基因的表达载体文库转染已引入RNA聚合酶基因的第一细胞系；
2.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法，其中，所述呼肠孤病毒科病毒选自轮状病毒属、卡多呼肠孤病毒属、米莫呼肠孤病毒属、环状病毒属、植物呼肠弧病毒属、东南亚十二节段RNA病毒属、水产呼肠孤病毒属、科罗拉多壁蝨热病毒属、质型多角体病毒属、迪诺维纳病毒属、斐济病毒属、昆虫非包涵体病毒属、真菌呼肠孤病毒属、正呼肠孤病毒属和水稻病毒属中的任一病毒。
3.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法，其中，所述RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶或线粒体聚合酶。
4.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法，其中，所述第一细胞系为BHK21细胞系、HEK293细胞系、HeLa细胞系、CHO细胞系、LNCaP细胞系、A549细胞系或hepG2细胞系。
5.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法，其中，所述第二细胞系为MA104细胞系、Vero细胞系、
6.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法，其中，在所述培养第二培养物中，转染后6小时至12小时将所述第二细胞系添加到第一培养物。
7.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法，其中，在所述培养第三培养物中，转染后36小时至48小时将所述胰蛋白酶添加到第二培养物。
8.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法，其中，所述胰蛋白酶以0.1ug/ml至1ug/ml的浓度添加。
9.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法，其中，所述启动子为T7启动子、Sp6启动子或CMV启动子。
10.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法，其中，所述表达载体文库的总DNA重量为每1ⅹ104至1ⅹ106个细胞1ug至20ug。
11.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法，其中，所述表达载体文库还包括针对编码加帽酶的D1R或D12L的表达载体。
12.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法，其中，当所述生长培养基为添加有胎牛血清的生长培养基时，在培养所述第三培养物之前，还包括：更换为未添加胎牛血清的培养基。
13.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法，其中，所述生长培养基为DMEM、EMEM或GMEM。
14.根据权利要求12所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法，其中，所述更换为未添加胎牛血清的培养基在转染后20小时执行。
15.一种通过根据权利要求1至14中任一项所述的方法制备的重配呼肠孤病毒科病毒。
16.一种用于制备重配轮状病毒的表达载体文库，其包括：多个表达载体，所述表达载体包括可与T7 RNA聚合酶结合的T7启动子和与所述启动子可操作地连接的轮状病毒基因片段cDNA，
17.根据权利要求16所述的用于制备重配轮状病毒的表达载体文库，其中，所述重配轮状病毒具有G1、G2、G3、G4、G9和P1中的任一种的血清型，
18.根据权利要求17所述的用于制备重配轮状病毒的表达载体文库，其中，在所述轮状病毒基因片段cDNA中，所述VP1基因片段cDNA包括SEQ ID NO：1的碱基序列；
19.根据权利要求16所述的用于制备重配轮状病毒的表达载体文库，其包括：表达盒，所述表达盒还包括与所述基因片段cDNA侧接的核酶编码序列。
20.根据权利要求19所述的用于制备重配轮状病毒的表达载体文库，其中，所述载体为质粒。
21.根据权利要求19所述的用于制备重配轮状病毒的表达载体文库，其中，所述表达载体文库包括选自以下任一种或多种质粒：包括针对由SEQ ID NO：19的碱基序列组成的VP1基因片段的表达盒的质粒；
22.根据权利要求21所述的用于制备重配轮状病毒的表达载体文库，其中，所述表达载体文库还包括：由SEQ ID NO：55的碱基序列组成的用于表达D1R的质粒；和
23.根据权利要求21所述的用于制备重配轮状病毒的表达载体文库，其中，所述轮状病毒表达载体文库的总DNA重量为每1ⅹ104至1ⅹ106个细胞1ug至20ug。
24.根据权利要求21所述的用于制备重配轮状病毒的表达载体文...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法，其包括：用含有外源基因的表达载体文库转染已引入rna聚合酶基因的第一细胞系；
2.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法，其中，所述呼肠孤病毒科病毒选自轮状病毒属、卡多呼肠孤病毒属、米莫呼肠孤病毒属、环状病毒属、植物呼肠弧病毒属、东南亚十二节段rna病毒属、水产呼肠孤病毒属、科罗拉多壁蝨热病毒属、质型多角体病毒属、迪诺维纳病毒属、斐济病毒属、昆虫非包涵体病毒属、真菌呼肠孤病毒属、正呼肠孤病毒属和水稻病毒属中的任一病毒。
3.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法，其中，所述rna聚合酶为t7 rna聚合酶、t3 rna聚合酶、sp6 rna聚合酶或线粒体聚合酶。
4.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法，其中，所述第一细胞系为bhk21细胞系、hek293细胞系、hela细胞系、cho细胞系、lncap细胞系、a549细胞系或hepg2细胞系。
5.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法，其中，所述第二细胞系为ma104细胞系、vero细胞系、hek细胞系、人肠上皮细胞、ht-29细胞系、caco2细胞系、llc-mk2细胞系、frhl-2细胞系、cv-1细胞系、cos-7细胞系、bsc-1细胞系或bgm细胞系。
6.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法，其中，在所述培养第二培养物中，转染后6小时至12小时将所述第二细胞系添加到第一培养物。
7.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法，其中，在所述培养第三培养物中，转染后36小时至48小时将所述胰蛋白酶添加到第二培养物。
8.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法，其中，所述胰蛋白酶以0.1ug/ml至1ug/ml的浓度添加。
9.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法，其中，所述启动子为t7启动子、sp6启动子或cmv启动子。
10.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法，其中，所述表达载体文库的总dna重量为每1ⅹ104至1ⅹ106个细胞1ug至20ug。
11.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法，其中，所述表达载体文库还包括针对编码加帽酶的d1r或d12l的表达载体。
12.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐基元，权泰佑，郑舒娟，朴敏廷，李建世，李泫周，
申请(专利权)人：SK生物科学株式会社，
类型：发明
国别省市：
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