【技术实现步骤摘要】
本申请涉及生物医药，特别涉及一种重组人白细胞介素-35及其制备方法和应用。
技术介绍
1、il-12家族成员都是重要的细胞因子，是由α链(p19、p28、p35)和β链(p40和ebi3)构成的异源二聚体。白细胞介素35(interleukin-35，il-35)是il-12细胞因子家族的一员，它与il-12家族中的其他成员(il-12、il-23、il-27、il-39)具有相似的结构，是由epstein-barr病毒诱导基因3(ebi3)和il-12p35组成的异二聚体分子，主要由调节性t细胞(treg)和调节性b细胞(bregs)分泌。
2、il-35作为一种抗炎和免疫抑制细胞因子可以通过调控t细胞、b细胞、树突状细胞和巨噬细胞的分化以及功能，在多种炎症反应和自身免疫性疾病的发生和发展中发挥重要作用。研究结果还显示il-35与多种人类疾病密切相关，包括感染性疾病、脓毒症、自身免疫性疾病、炎症和肿瘤。因此，il-35有望成为反映疾病进展和预后的新生物标志物，或作为疾病治疗的新靶点，具有广泛的临床治疗前景。
3、il-12p35含有7个半胱氨酸，ebi3含有4半胱氨酸，il-12p35与ebi3两个亚基相互之间能够通过非共价键结合形成异二聚体，同时，亚基自身也会结合形成p35：p35或ebi3：ebi3同型二聚体乃至多聚体的结构。il-35的受体是由il-12rβ2和gp130构成的二聚体，与il-12和il-27共享受体链。il-35通过由il-12rβ2和gp130组成的异二聚体或同源二聚体受体传递
4、目前有研究尝试过从大肠杆菌中纯化重组生物活性il-35的方案，但无法获得有活性的il-35。cn116478926a记载了如下方案：将带有人白介素-35基因的双质粒表达系统(p35亚基的天然核苷酸序列合成到pxc17.4质粒上，ebi3亚基的天然核苷酸序列合成到pcdna3.1质粒上)瞬时转染至cho-k1细胞的基因组中，经过多次筛选试验和生物活性检测后最终筛选得到高效表达人白介素-35细胞株，提高了il-35的表达量，但是由于表达后的分子，仍存在同源二聚体及多聚体等情况，难以纯化获得高纯的具备生物活性的il-35蛋白。也有研究尝试将il-35设计成一种共价连接ebi3和p35的异二聚体蛋白，可能为受到ebi3和p35结合的空间位置的影响所致，所获得的rhil-35活性并不稳定。还有尝试构建将fc片段和il-35的融合蛋白，但所得重组il-35的生物学活性有待提升，传统的构建fc片段和il-35融合蛋白的技术方案例如专利技术专利申请cn106075401a和硕士论文“重组人白介素-35的真核表达及生物功能的研究”中记载的方案，其中：
5、cn106075401a记载了合成融合il-35的ebi3、p35、linker和融合蛋白的氨基酸序列，合成的il-35融合蛋白是在il-35的c末端链接人的igg1的fc所得。fc融合蛋白的优点是可以将病原体的部分抗原肽与igg-fc片段进行融合，诱导机体产生抗原特异性免疫应答，增强il-35的抗病能力。专利技术中将单质粒转染到expi293e细胞，在转染第6天收集细胞悬液，对所得细胞悬液进行高速离心，弃去细胞碎片后将上清中il-35用0.45μm滤网超滤后进行浓缩，浓缩后的液体通过液体交换装置，洗脱至无杂峰得到il-35融合蛋白，通过与阳性对照蛋白做比较显示il-35融合蛋白表达成功。
6、“重组人白介素-35的真核表达及生物功能的研究”记载了构建il-35(ebi3+linker+p35)
7、真核表达载体pstep2-il35-fc，并转染到hek293t细胞中，10l的反应器中培养7天收获上清，利用釆用蛋白亲和色谱柱来分离纯化获得重组人il-35-fc蛋白，通过sds-page及western blot鉴定蛋白的表达并检测了rhil-35生物活性进行了检测。
技术实现思路
1、基于此，本申请一个或者多个实施例提供一种重组人白细胞介素-35及其制备方法和应用。包括如下技术方案：
2、本申请的一个或者多个实施例提供一种重组人白细胞介素-35，其具有人白细胞介素-35生物活性，为第一融合多肽和第二融合多肽的异二聚体；
3、自n端至c端，
4、所述第一融合多肽包括seq id no.11所示的第一活性肽以及第一辅助肽，
5、所述第二融合多肽包括seq id no15所示的第二活性肽以及第二辅助肽，
6、所述第一辅助肽和所述第二辅助肽形成kih结构。
7、在本申请的一些实施方式中，所述重组人白细胞介素-35满足如下条件中的一个或者多个：
8、(1)所述第一活性肽以及所述第一辅助肽直接连接；
9、(2)所述第二活性肽以及所述第二辅助肽直接连接；以及，
10、(3)所述第一辅助肽和所述第二辅助肽各自独立地选自抗体fc片段的突变肽。
11、在本申请的一些实施方式中，所述第一辅助肽和所述第二辅助肽各自独立地选自igg抗体fc片段的突变肽。
12、在本申请的一些实施方式中，所述第一融合多肽和所述第二融合多肽的n端还连接有信号肽。
13、在本申请的一些实施方式中，所述信号肽的n端还连接有第一蛋白酶切位点片段。
14、在本申请的一些实施方式中，所述第一融合多肽和所述第二融合多肽的c端各自独立地连接有第二蛋白酶切位点片段。
15、本申请的一个或者多个实施例还提供一种核酸分子，其编码所述的重组人白细胞介素-35。
16、本申请的一个或者多个实施例还提供一种重组载体，其包括所述的核酸分子。
17、本申请的一个或者多个实施例还提供一种重组细胞，其表达所述的重组人白细胞介素-35。
18、本申请的一个或者多个实施例还提供一种所述的重组细胞的构建方法，其包括将所述的核酸分子导入宿主细胞构建重组细胞的步骤。
19、本申请的一个或者多个实施例还提供一种所述的重组人白细胞介素-35的制备方法，其包括如下步骤：
20、培养所述的重组细胞；以及，
21、从所得培养物中分离所述重组人白细胞介素-35。
22、本申请的一个或者多个实施例还提供一种所述的重组人白细胞介素-35、所述的核酸分子、所述的重组载体或者所述的重组细胞在制备治疗癌症、自体免疫性疾病或者发炎性疾病的药物中的应用。
23、本申请的一个或者多个实施例还提供一种药物，其包括所述的重组人白细胞介素-35、所述的核酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.重组人白细胞介素-35，其具有人白细胞介素-35生物活性，为第一融合多肽和第二融合多肽的异二聚体；
2.根据权利要求1所述的重组人白细胞介素-35，其满足如下条件中的一个或者多个：
3.根据权利要求1至2中任一项所述的重组人白细胞介素-35，其中，所述第一融合多肽和所述第二融合多肽的N端各自独立地还连接有信号肽；
4.核酸分子，其编码权利要求1至3中任一项所述的重组人白细胞介素-35。
5.重组载体，其包括权利要求4所述的核酸分子。
6.重组细胞，其表达权利要求1至3中任一项所述的重组人白细胞介素-35。
7.权利要求6所述的重组细胞的构建方法，其包括将权利要求4所述的核酸分子导入宿主细胞构建重组细胞的步骤。
8.权利要求1至3中任一项所述的重组人白细胞介素-35的制备方法，其包括如下步骤：
9.权利要求1至3中任一项所述的重组人白细胞介素-35、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的重组载体或者权利要求6所述的重组细胞在制备治疗癌症、自体免疫性疾病或者发炎性疾病的药物中的应用
10.一种药物，其包括权利要求1至9中任一项所述的重组人白细胞介素-35、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的重组载体或者权利要求6所述的重组细胞，以及药学上可以接受的载体。
...【技术特征摘要】
1.重组人白细胞介素-35，其具有人白细胞介素-35生物活性，为第一融合多肽和第二融合多肽的异二聚体；
2.根据权利要求1所述的重组人白细胞介素-35，其满足如下条件中的一个或者多个：
3.根据权利要求1至2中任一项所述的重组人白细胞介素-35，其中，所述第一融合多肽和所述第二融合多肽的n端各自独立地还连接有信号肽；
4.核酸分子，其编码权利要求1至3中任一项所述的重组人白细胞介素-35。
5.重组载体，其包括权利要求4所述的核酸分子。
6.重组细胞，其表达权利要求1至3中任一项所述的重组人白细胞介素-35。
7.权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：王建刚，张凯跃，胡祥维，韩倩，乔磊，郑彬彬，吴明远，
申请(专利权)人：康立泰生物医药青岛有限公司，
类型：发明
国别省市：
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