【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及多重免疫荧光染色领域，具体涉及多重染色试剂及其染色方法和应用。
技术介绍
1、荧光显微技术是生命科学领域的关键技术之一。最先进的组学方法结合了荧光显微镜和复杂的实验步骤，可以在样本的数百万像素中可视化数以万计的特征。这些组学方法需要在数天或数周的迭代化学和成像周期中精确控制温度、试剂应用和图像采集参数。这些方法的自动执行实现了稳健的、可重复的数据生成。
2、免疫组化染色是一种研究组织形态和原位蛋白表达的常见技术。多重免疫荧光染色技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。常规的多重免疫荧光实验包括样品处理、固定、封闭、抗体孵育以及最后的封片、观察等步骤。传统组织切片荧光染色技术中需包含长时间的封闭流程和抗体孵育流程，不利于快速检测和报告输出。优化免疫荧光染色的实验条件、规范实验操作步骤是保证免疫荧光实验结果准确、可靠的关键。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供多重染色试剂及其染色方法和应用。
2、本专利技术提供了多重染色的试剂组合，其包括洗脱液、一抗试剂、清洗液、和二抗试剂，其中：
3、所述洗脱液包括缓冲液和抗氧化剂，所述抗氧化剂为β-巯基乙醇或dtt；
4、所述清洗液包括巯基封闭剂。
5、进一步的，所述洗脱液中，
6、β-巯基乙醇的浓度为95mm～109mm，所述dtt的浓度为2mm～10mm；
7、缓冲液为65mm～74mm的sds和
8、更进一步的，所述洗脱液为：
9、由水和102mmβ-巯基乙醇、69mm sds和62.5mm tris-hcl组成；
10、或由水和5mm dtt，69mm sds和62.5mm tris-hcl组成。
11、本专利技术所述清洗液中，巯基封闭剂选自bsa，明胶，血清中的一种或多种。
12、进一步的，所述清洗液为含有体积分数(v/v)为0.05％～0.15％ tween-20和质量浓度(w/v)为0.20％～0.30％明胶的pbs溶液。
13、更进一步的，所述清洗液为含有体积分数(v/v)为0.1％的tween-20和质量浓度(w/v)为0.25％明胶的pbs溶液。
14、本专利技术所述的洗脱液和清洗液与传统的洗脱液和清洗液相比做了改进，使得在清洗的同时封闭-sh，从而降低染色背景，提高信噪比。同时洗脱液和清洗液的改进使染色过程不需要封闭的步骤即可得到较好的染色结果，节省了染色的时间，简化了染色的流程。
15、本专利技术中，所述一抗试剂包括pbs缓冲液和染色剂标记的一抗；所述二抗试剂包括pbs缓冲液和染色剂标记的二抗。
16、本明所述抗体根据实际实验需要进行替换；所述的抗体包括单克隆抗体和/或多克隆抗体，所述的抗体来源可以包括兔、鼠、猪、羊、鸡等；所述抗体染色的荧光基团包括与一抗偶联的荧光染色基团，和/或与二抗偶联的荧光染色基团；所述与一抗偶联的荧光染色基团包括但不限于gfap、iba-1、th、pcp4、nfh、alexa fluor，fitc，pe，apc，percp；所述与二抗偶联的荧光染色基团包括但不限于hrp，ap，alexa fluor 532、alexa fluor 594，或其衍生物apaap，pap。
17、本专利技术的一些具体实施例中，所使用的一抗来源于鸡和兔；所述的二抗来源于羊，所述二抗的类型为羊抗兔igg或羊抗鸡igg。
18、本专利技术提供了多重免疫荧光染色方法，其为使用本专利技术所述的试剂组合对样本进行处理。
19、进一步的，所述对样本进行处理步骤包括：抗体洗脱液处理样本、第一清洗、一抗试剂染色、第二清洗、二抗试剂染色和第三清洗。其中，所述洗脱液处理温度为50～65℃，优选的为56℃，洗脱液处理时间为10～30分钟，优选的为10分钟；所述抗体染色的时间为10～30分钟，染色温度为37℃～42℃。
20、本专利技术所述的多重免疫荧光染色方法中，所述第一清洗、第二清洗和第三清洗中，清洗的次数独立的选自3～8次，每次清洗5～15分钟。
21、进一步的，所述第一清洗、第二清洗和第三清洗中，清洗时间为1～15分钟，优选的为5分钟。
22、所述第一清洗所用试剂为清洗液，清洗的次数为2～5次，流速为50微升～1200微升每分钟；
23、所述第二清洗所用的试剂为清洗液，清洗的次数为2～5次，流速为50微升～1200微升每分钟；
24、所述第三清洗所用的试剂为清洗液，清洗的次数为2～5次，流速为50微升～1200微升每分钟。
25、本专利技术所述的多重免疫荧光染色方法中，所述样本处理后，还包括抓拍样本染色前、样本染色后及洗脱后的照片，经背景校正后获得样本的免疫荧光染色图片；所述照片抓拍的参数为：532nm激光500mw～3.1w，647nm激光500mw～3.1w，曝光时间40ms～1s。优选的为，532nm激光2w，647nm激光3.1w，曝光时间40ms。
26、所述背景校正为将采集到的抗体染色后荧光图片与荧光染色前的背景图片做校正；所述背景校正采用差值校正。
27、因组织背景荧光本身较高，传统多重免疫荧光需进行长时间或高浓度抗体孵育从而降低信噪比，实现更好的信号分离。本专利技术对抗体孵育的时间和温度做了调整，升高染色时样品温度以提高染色特异性；同时对同一位置高重复性背景矫正，进一步缩短抗体孵育的时间并降低背景干扰。
28、本专利技术所述的多重免疫荧光染色方法中，所述对样本进行处理前，还包括样本打孔的步骤；所述样本打孔步骤为使用打孔剂打孔或电击打孔后清洗；所述打孔时间为5～15分钟；所述清洗的试剂为清洗液；清洗的次数为1～5次，时间为10～60秒，流速为50～1200微升每分钟。
29、进一步的，所述打孔剂为tritonx-100，saponin，tween-20中的一种或多种；所述打孔剂中，tritonx-100的体积分数为0.1％～0.5％；saponin的体积分数为0.1％～0.5％；tween-20的体积分数为0.1％～0.5％。
30、本专利技术所述的多重免疫荧光染色方法中，所述的样本包括但不限于石蜡切片、冰冻切片或新鲜组织切片中的至少一种。在一些具体实施例中，本专利技术以石蜡切片、冰冻切片为样本进行多重免疫荧光染色，结果表明，本专利技术所述的多重免疫荧光染色方法染色效果好，染色时间短。
31、本专利技术所述的多重免疫荧光染色方法，其可与仪器相互配合使用，也可以独立于仪器使用，本专利技术对此不作限定。一些具体实施例中，本专利技术所述的多重免疫荧光染色方法配合华大测序仪mgiseq2000使用。
32、传统洗脱液中的还原剂(如二巯基乙醇，dtt和tcep等)用于打开抗体与蛋白质上-sh基团形成的-s-s-共价键，故在多重免疫荧光的抗体洗脱步骤本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.多重染色的试剂组合，其包括洗脱液、一抗试剂、清洗液和二抗试剂，其中：
2.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述洗脱液中：
3.根据权利要求1～3任一项所述的试剂组合，其特征在于，所述洗脱液为：
4.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述清洗液中的巯基封闭剂选自BSA，明胶，血清中的一种或多种。
5.根据权利要求1或4所述的试剂组合，其特征在于，所述清洗液为含有体积分数(V/V)为0.05％～0.15％Tween-20和质量浓度(W/V)为0.20％～0.30％明胶的PBS溶液。
6.根据权利要求5所述的试剂组合，其特征在于，所述清洗液为含有体积分数(V/V)为0.1％的Tween-20和质量浓度(W/V)为0.25％明胶的PBS溶液。
7.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，
8.多重免疫荧光染色方法，其特征在于，使用权利要求1～7任一项所述的试剂组合对样本进行处理。
9.根据权利要求8所述的多重免疫荧光染色方法，其特征在于，所述对样本进行处理步骤依次包括：
10.根据权利要求9所述的多重免疫荧光染色方法，其特征在于，
11.根据权利要求10所述的多重免疫荧光染色方法，其特征在于，所述洗脱液处理样本的条件为56℃处理10分钟。
12.根据权利要求8或9所述的多重免疫荧光染色方法，其特征在于，所述第一清洗、第二清洗和第三清洗中，清洗的次数独立的选自3～8次，每次清洗5～15分钟。
13.根据权利要求8或9或12任一项所述的多重免疫荧光染色方法，其特征在于，
14.根据权利要求8或9所述的多重免疫荧光染色方法，其特征在于，所述样本处理后，还包括抓拍样本染色前、样本染色后和洗脱后的照片，经背景校正后获得样本免疫荧光染色图片；
15.根据权利要求8或9所述的多重免疫荧光染色方法，其特征在于，所述对样本进行处理前，还包括样本打孔的步骤；所述样本打孔步骤为使用打孔剂打孔或电击打孔后清洗；所述打孔时间为5～15分钟；所述清洗的试剂为清洗液；清洗的次数为1～5次，时间为10～60秒，流速为50～1200微升每分钟。
16.根据权利要求15所述的多重免疫荧光染色方法，其特征在于，所述打孔剂为TritonX-100，Saponin，Tween-20中的一种或多种的水溶液；所述打孔剂中，TritonX-100的体积分数为0.1％～0.5％；Saponin的体积分数为0.1％～0.5％；Tween-20的体积分数为0.1％～0.5％。
17.根据权利要求8～16任一项所述的多重免疫荧光染色方法，其特征在于，所述的样本包括石蜡切片、冰冻切片或新鲜组织切片中的至少一种。
18.一种用于多重免疫荧光染色的自动化平台，所述自动化平台包括：
19.根据权利要求18所述的自动化平台，其特征在于，所述样品腔位于移动平台上，用于调节所述待成像样本的位置。
20.根据权利要求18所述的自动化平台，其特征在于，所述液路模块的试剂腔中，打孔剂腔中放置有打孔剂；洗脱液腔放置有洗脱液；一抗试剂放置有一抗试剂；清洗液腔放置有清洗液；二抗试剂腔放置有二抗试剂；每个试剂腔与所述样品腔分别通过管线连通，并且所述管线上设有选通阀。
21.根据权利要求18所述的自动化平台，其特征在于，所述自动化平台还包括控制模块，所述控制模块可编程，用于控制所述液路模块对所述样品腔通入或排出试剂，并控制所述成像模块对所述待成像样本进行成像。
22.根据权利要求18或21所述的自动化平台，所述控制模块控制打孔剂、洗脱液、一抗试剂、清洗液和二抗试剂从对应的试剂腔依次通入至所述样品腔和从所述样品腔排出。
23.根据权利要求18或21所述的自动化平台，其特征在于，所述自动化平台还包括温度控制模块，用于控制所述样品腔和所述试剂腔中流体的温度。
24.根据权利要求18或21或23任一项所述的自动化平台，其特征在于，所述自动化平台还包括测序系统，其中样品腔的流体芯片固定于测序系统的芯片台上。
25.根据权利要求19～24任一项所述的自动化平台，其特征在于，所述自动化平台进行多重免疫荧光染色的步骤包括：
26.权利要求8～17任一项所述的多重免疫荧光染色方法在组织形态、适配体染色、蛋白互作，和/或组织原位抗原表达中的应用。
27.根据权利要求26所述的应用，其特征在于，所述组织形态包括不同发育期的胚胎形态、...
【技术特征摘要】
1.多重染色的试剂组合，其包括洗脱液、一抗试剂、清洗液和二抗试剂，其中：
2.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述洗脱液中：
3.根据权利要求1～3任一项所述的试剂组合，其特征在于，所述洗脱液为：
4.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述清洗液中的巯基封闭剂选自bsa，明胶，血清中的一种或多种。
5.根据权利要求1或4所述的试剂组合，其特征在于，所述清洗液为含有体积分数(v/v)为0.05％～0.15％tween-20和质量浓度(w/v)为0.20％～0.30％明胶的pbs溶液。
6.根据权利要求5所述的试剂组合，其特征在于，所述清洗液为含有体积分数(v/v)为0.1％的tween-20和质量浓度(w/v)为0.25％明胶的pbs溶液。
7.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，
8.多重免疫荧光染色方法，其特征在于，使用权利要求1～7任一项所述的试剂组合对样本进行处理。
9.根据权利要求8所述的多重免疫荧光染色方法，其特征在于，所述对样本进行处理步骤依次包括：洗脱液处理样本、第一清洗、一抗试剂染色、第二清洗、二抗试剂染色和第三清洗。
10.根据权利要求9所述的多重免疫荧光染色方法，其特征在于，
11.根据权利要求10所述的多重免疫荧光染色方法，其特征在于，所述洗脱液处理样本的条件为56℃处理10分钟。
12.根据权利要求8或9所述的多重免疫荧光染色方法，其特征在于，所述第一清洗、第二清洗和第三清洗中，清洗的次数独立的选自3～8次，每次清洗5～15分钟。
13.根据权利要求8或9或12任一项所述的多重免疫荧光染色方法，其特征在于，
14.根据权利要求8或9所述的多重免疫荧光染色方法，其特征在于，所述样本处理后，还包括抓拍样本染色前、样本染色后和洗脱后的照片，经背景校正后获得样本免疫荧光染色图片；
15.根据权利要求8或9所述的多重免疫荧光染色方法，其特征在于，所述对样本进行处理前，还包括样本打孔的步骤；所述样本打孔步骤为使用打孔剂打孔或电击打孔后清洗；所述打孔时间为5～15分钟；所述清洗的试剂为清洗液；清洗的次数为1～5次，时间为10～60秒，流速为50～1200微升每分钟。
16.根据权利要求15所述的多重免疫荧光染色方法，其特征在于，所述打孔剂为tritonx-10...
【专利技术属性】
技术研发人员：王毅雄，杨梦，
申请(专利权)人：深圳华大智造科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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