一种外指引序列文库筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种外指引序列文库筛选方法，包括：ａ）以外指引序列克隆为模板，对外指引序列表达框进行ＰＣＲ扩增；ｂ）以ＰＣＲ产物为模板，对外指引序列进行转录制备；ｃ）把转录产物与靶标ＲＮＡ以及ＲＮａｓｅ　Ｐ混合反应，以体外筛选功能外指引序列。利用本发明专利技术公开的技术可以得到新的靶向外指引序列。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物
，更具体地，本专利技术涉及一种外指引序列文库筛选方 法，从而方便从文库中筛选出可用作基因治疗意义的外指引序列EGS。
技术介绍
外指引序列(External Guided Sequence,以下均简称EGS)技术于80年代后期首先 发现，其主要功能是体内定向灭活功能基因，EGS为小分子RNA功能分子，因而应该 属于广义的RNA干扰技术(RNAi)。但与目前流行的RNAi技术不同的是，EGS采用 更短的RNA分子(10mer)，即可特异作用于靶基因，从而导致靶基因定向灭活。目前 针对EGS的国际专利已存在，但美国专利说明书US6，057，153、 US6,783，981和 US5,877,162等主要是针对单个EGS分子的设计。目前仍没有实用的可用于高通量EGS 的筛选的EGS文库(简称LEGS),而这种文库的产生将有益于针对特殊疾病如爱滋病、 肝炎及癌症等的基因新药开发。
技术实现思路
本专利技术提供，包括a)以外指引序列克隆为模板，对 外指引序列S表达框进行PCR扩增；b)以PCR产物为模板，对外指引序列进行转录制 备；c)把转录产物与靶标RNA以及RNaseP混合反应，以体外筛选功能外指引序列。附图说明图1为EGS文库设计图，其中图1-1: 3/4 EGS设计框架来源于大肠杆菌酪氨酸转运RNA的前体序列； 图l-2:外指引序列文库，外指引序列识别结构域由随机碱基组成；为了避免 CCA序列直接暴露给核酸酶，UUU序列连接在它的3'末端； 图1-3:外指引序列文库与潜在的靶标RNA形成的复合体，箭头指示了核酸酶p的切割位点。图2为引物FLEGSp和RLEGSp示意图；部分随机化的寡聚核苷酸FLEGSp和 RLEGSp由两部分组成， 一部分用于扩增pET28a-D载体(除了不包含T7启动子和T7 终止子之间的片段以外，可等同于pET28a载体)，另一部分用于扩增外指引序列文库表达框；图3为EGS文库构建示意图，其中图3-1: pET28a-LEGS构建的流程图3-2: pET28a-LEGS的PCR产物鉴定图，箭头指示了大小为5-kb的DNA 条带；图4为EG S文库鉴定示意图，其中图4-1: pET28a-EGS克隆酶切鉴定模式图，RV1泳道为含一个HincII酶切位点 的pET28a-EGS克隆被HincII酶切后的酶切示意图，RV2泳道为含二或三个 HincII酶切位点的pET28a-EGS克隆被HincII酶切后的酶切示意图，V泳道为 pET28a被HincII酶切后的酶切示意图,箭头指示了大小为5-kb的DNA条带； 图4-2: pET28a-EGS克隆酶切鉴定图，1到42号泳道均为含一个HincII酶 切位点的pET28a-EGS克隆被Hindi酶切后的酶切图谱，V泳道为pET28a被 HincII酶切后的酶切图谱，箭头指示了大小为5-kb的DNA条带； 图4-3: pET28a-EGS克隆酶切鉴定图，1号泳道均为为含两个或三个HincII 酶切位点的pET28a-EGS克隆被HincII酶切后的酶切图谱，V泳道为pET28a 被HincII酶切后的酶切图谱，箭头指示了大小为5-kb的DNA条带； 图4-4:部分EGS表达框序列的多重比较结果。 图5为体外转录制备EGS示意图，其中 图5-l: EGS制备流程图； 图5-2: EGS的体外转录模板鉴定图； 图5-3:转录制备的EGS产物； 图6为EGS文库功能筛选意图，其中 图6-1:体外筛选功能性EGS示意图； 图6-2:功能性EGS体内验证示意图； 图7为EGS-c-myc功能鉴定示意图，其中 图7-1:为EGS-c-myc结构示意图7-2:为EGS-D-c-myc结构示意图(EGS-c-myc的阴性对照)，园形标记标示 了碱基突变；图7-3:为c-myc mRNA被RNaseP体外切割所产生的产物的示意图，泳道M 为RNA Marker,箭头指示了大小为2-kb的RNA条带，星号指示了大小为40.5-kb的RNA条带，泳道1为c-myc mRNA被RNaseP体外切割所产生的产 物；图7-4为c-myc表达水平检测结果，其中图7-4-1为荧光实时定量PCR检测结果，图7-4-2:为Western biota检测结果； 图7-5为细胞凋亡检测结果，其中图7-5-1:为EGS-D-c-myc所导致的凋亡率；图7-5-2: EGS-c-myc所导致的凋亡率。具体实施例方式1、 EGS文库的设计1.1选择3/4EGS(图1-1)作为EGS文库的设计框架。3/4EGS的一级结构(核 酸序列)和二级结构来源于大肠杆菌(^&cten'c/2/ co/z')的酪氨酸转运RNA(tRNATyr), 其已被广泛采用并被大量实验结果验证。1.23/4EGS的靶标配对区域由随机碱基组成，这就是EGS的理论文库(图1-2)。1.3在3/4 EGS最3，端的CCA序列的末端添力nUUU序列以避免CCA序列直 接暴露于核酸酶(RNAase)(图1-2)。因该文库包含了靶向任何靶标RNA的功能性EGS (图1-3)，故该文库也可被称为 EGS随机文库2、 EGS文库的构建策略通过替换T7终止子和T7启动子之间的区域，EGS文库的表达框被克隆至pET28a 载体而构建pET28a-LEGS。pET28a-LEGS为含有EGS文库表达框的重组载体，其中EGS 文库表达框的转录受T7终止子和T7启动子的控制。把pET28a-LEGS转化至DH5a感 受态细胞中以筛选pET28a-EGS-clone——含有某一特定EGS表达框的重组载体，其中 EGS文库表达框的转录受T7终止子和T7启动子的控制(图3-1)。此策略基于PCR技术直接把EGS文库表达框克隆至目标载体，这可避免EGS文库 中某些表达框被遗漏。3、 EGS文库的构建方法53.1利用Vector NTI软件设计引物FLEGSp SEQ ID NO:l和RLEGSp SEQ ID NO:2 (图2)，第二个引物是RLEGSp。这对引物由两部分组成， 一部分用于扩增pET28a-D载体(除了不包含T7启动子 和T7终止子之间的片段以外，可等同于pET28a载体)，另一部分用于扩增外指引序列 文库表达框。这可通过PCR技术直接把EGS文库表达框克隆至目标载体。3.2利用9700 DNA synthesizer (Applied biosystem)合成FLEGSp和FLEGSp,并对它们的5'端进行磷酸化修饰。3.3利用Phusion High-Fidelity PCR Kit (NEB)按照以下反应体系和反应程序在 9700 Thermal cycler(Applied biosystem)进行PCR扩增(图3-2)。通过PCR扩增把EGS 的理论文库的表达框克隆至pET28a载体(MERCK公司)而制备pET28a-LEGSL。图3-2结果显示PCR产物大小与理论预测一致。反应体系:组分各组分所占体积(按50W 反应体系计算)终浓度高保真性DNA聚合酶的10微升反应缓冲液(5x)10mM的dNTP混合物l微升200微摩/个引物A(IO微摩)2.5微升0.5微摩引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种外指引序列文库筛选方法，包括：　ａ）以外指引序列克隆为模板，对外指引序列Ｓ表达框进行ＰＣＲ扩增；　ｂ）以ＰＣＲ产物为模板，对外指引序列进行转录制备；　ｃ）把转录产物与靶标ＲＮＡ以及ＲＮａｓｅ　Ｐ混合反应，以体外筛选功能外指引序列。

【技术特征摘要】
1.一种外指引序列文库筛选方法，包括a)以外指引序列克隆为模板，对外指引序列S表达框进行PCR扩增；b)以PCR产物为模板，对外指引序列进行转录制备；c)把转录产物与靶标RNA以及RNase P混合反应，以体外筛选功能外指引序列。2. 权利要求1所述的外指引序列文库筛选方法，其中步骤a)中外指引序列克隆...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑文岭，严启滔，刘媛媛，马文丽，
申请(专利权)人：广州金琪基因技术研究发展中心，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]