【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于中药活性成分提取及分析，具体涉及一种快速筛选及分析中药中dpp4酶抑制剂的方法，尤其是快速筛选及分析人参中dpp4酶抑制剂的方法。
技术介绍
1、天然的glp-1是一种由人体自身胰高血糖素原基因转录的肠促胰岛素激素，它由主要存在于回肠、结肠和直肠中的肠道l细胞分泌，进食刺激后诱导其合成分泌，可以促进高血糖状态下的胰岛素分泌，从而降低血糖。glp-1在体内具有多重生理功能，如：增加饱腹感、提高学习能力和保护神经、减缓低血糖所致的胃排空加速等；对于血糖而言，glp-1与体内glp-1受体相结合后，可以促进葡萄糖依赖性胰岛素分泌，促进胰岛素合成，同时抑制胰高血糖素的产生，从而发挥降血糖功效。相比于其它糖尿病治疗药物，glp-1有两个最显著的优点：其一，glp-1在高血糖水平时分泌，并且在血糖水平正常后停止分泌以避免低血糖；其二，glp-1可以刺激胰岛β细胞的增殖并抑制其细胞凋亡，这甚至可以逆转2型糖尿病。由于这两大优势，glp-1作为新型促胰岛素分泌剂，在治疗2型糖尿病方面具有巨大的潜力。
2、然而，天然glp-1在体内极不稳定，半衰期仅为1-2分钟，其被二肽基肽酶-4(dpp4)降解而快速失活，而dpp4酶抑制剂可以抑制dpp4酶的活性，从而延长内源性glp-1的作用时间，发挥降血糖的功效，由此可见，dpp4酶是与糖尿病相关的一个至关重要靶标。目前，临床上常用的dpp4酶抑制剂如西格列汀、沙格列汀、维格列汀等均为化药，这些药物在发挥降糖功效的同时，均伴有一定的副作用，如关节痛、胰腺炎、体重轻度增加等。因此，
3、中药是一个巨大的天然活性成分宝库，从中药中筛选活性成分，可以为药物的开发提供了新的思路和方法。人参是一味传统的药食两用中药，已经在中国和亚洲应用数千年。现代研究表明，人参具有各种药理活性，除了抗肿瘤、抗衰老、抗氧化、抗疲劳、提高免疫功能、智力和学习能力、保护血管、肝脏和肾脏、调控中枢神经系之外，人参还具有降血糖功效，已经被用于糖尿病的辅助治疗。因此，本领域期待从具有降糖功效的人参中筛选具有降糖活性的dpp4酶抑制剂，为降糖药物的开发奠定基础，但到目前为止，从人参以及其它中药中筛选dpp4抑制剂的方法尚未见报道。
技术实现思路
1、为此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种快速筛选及分析中药中dpp4酶抑制剂的方法，所述方法运用亲和超滤质谱技术可以从中药中快速筛选dpp4酶抑制剂；
2、本专利技术所要解决的第二个技术问题在于提供一种快速筛选及分析人参及其提取物中dpp4酶抑制剂的方法。
3、为解决上述技术问题，本专利技术所述的一种快速筛选及分析中药中dpp4酶抑制剂的方法，包括如下步骤：
4、(1)孵育：将中药和/或中药提取物加入dpp4酶进行共孵育，得到dpp4酶-配体结合物的样品液，未结合的小分子化合物则游离出来；另取所述中药和/或中药提取物加入等量缓冲液进行孵育，得到空白液；
5、(2)超滤-解离：分别将所述样品液和空白液进行超滤处理，dpp4酶-配体结合物被保留在超滤离心管内，而大部分尚未结合的小分子化合物则被除去，并收集超滤物加入解离剂进行解离处理，释放出小分子配体化合物，收集解离液，分别得到样品液和空白液的解离液；
6、(3)lc-ms数据采集：分别对所述样品液和空白液的解离液进行lc-ms扫描及分析，运用高分辨质谱技术得到lc-ms数据；
7、(4)lc-ms数据统计分析：将所述lc-ms数据进行分析，分别获得所述解离液中每个化合物的信息，初步筛选所需dpp4酶抑制剂。
8、具体的，所述快速筛选及分析中药中dpp4酶抑制剂的方法，所述步骤(1)中，所述缓冲液包括tris-hcl缓冲液；
9、优选的，所述tris-hcl缓冲液的浓度为40-60mm，ph 7.3-7.6；
10、优选的，所述孵育步骤的温度为35-40℃，孵育时间为20-40min；
11、优选的，所述中药、中药提取物和/或所述dpp4酶配制成溶液；
12、优选的，所述中药、中药提取物和/或所述dpp4酶的溶解溶液包括所述tris-hcl缓冲液；
13、优选的，所述中药和/或中药提取物的溶液配制浓度为0.05-0.2mg/ml；
14、优选的，所述dpp4酶的溶液配制浓度为160-200ng/μl。
15、优选的，所述孵育步骤中，以25μl的0.1mg/ml的人参提取物样品溶液与25μl的179ng/μl的dpp4酶溶液共孵育，孵育温度为37℃，孵育时间为30min。
16、具体的，所述快速筛选及分析中药中dpp4酶抑制剂的方法，所述步骤(2)中：
17、所述超滤步骤采用低蛋白结合率的超滤膜；优选的，所述超滤膜的分子截留量为20-40kda，更优选30kda；和/或，
18、所述解离剂包括甲醇；和/或，
19、优选的，所述步骤(2)中，还包括将所述超滤物进行漂洗的步骤，超滤后的dpp4酶-配体结合物用加适当的缓冲液进行多次漂洗，离心，以尽可能的除去所有未结合的小分子化合物；
20、优选的，所述漂洗步骤采用乙酸铵缓冲溶液；优选的，所述乙酸铵缓冲溶液的浓度为100-200mm，优选多次漂洗。
21、优选的，所述步骤(2)中，每次所述漂洗和/或解离步骤后还包括进行离心的步骤，优选离心转速为12000-15000r/min。
22、具体的，所述快速筛选及分析中药中dpp4酶抑制剂的方法，所述步骤(3)中，还包括分别将所述样品液和空白液的解离液吹干后，收集残留物并加入定容溶剂进行复溶的步骤，分别得到所述样品液的分析样本和所述空白液的空白样本；
23、优选的，所述定容溶剂包括甲醇-水溶液；
24、优选的，所述甲醇-水溶液的体积比为40-60：60-40(v/v)。
25、优选的，所述步骤(3)中，用uplc-orbitrap exploris 240(thermo scientific，usa)进行解离液的数据采集。
26、具体的，所述快速筛选及分析中药中dpp4酶抑制剂的方法，所述步骤(4)中，所述数据统计分析步骤通过将获得的质谱数据中的所有化合物进行提取，进而获得每个化合物的分子量、保留时间以及峰面积信息；
27、优选的，所述数据统计分析步骤采用compound discoverertm软件(thermoscientifictm，版本3.2.0.421)进行数据处理。
28、具体的，所述快速筛选及分析中药中dpp4酶抑制剂的方法，所述步骤(4)中，所述数据统计分析步骤包括：
29、(1)将收集的lc-ms数据导入compound discoverertm软件(thermosci本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种快速筛选及分析中药中DPP4酶抑制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述快速筛选及分析中药中DPP4酶抑制剂的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述缓冲液包括Tris-Hcl缓冲液；
3.根据权利要求1或2所述快速筛选及分析中药中DPP4酶抑制剂的方法，其特征在于，所述步骤(2)中：
4.根据权利要求1-3任一项所述快速筛选及分析中药中DPP4酶抑制剂的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，还包括分别将所述样品液和空白液的解离液吹干后，收集残留物并加入定容溶剂进行复溶的步骤，分别得到所述样品液的分析样本和所述空白液的空白样本；
5.根据权利要求1-4任一项所述快速筛选及分析中药中DPP4酶抑制剂的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述数据统计分析步骤通过将获得的质谱数据中的所有化合物进行提取，进而获得每个化合物的分子量、保留时间以及峰面积信息；
6.根据权利要求1-5任一项所述快速筛选及分析中药中DPP4酶抑制剂的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，还包括将初步筛选的所述DPP4酶抑制剂进
7.一种快速筛选及分析人参中DPP4酶抑制剂的方法，其特征在于，所述方法包括以人参提取物为原料，按照权利要求1-6任一项所述方法进行筛选及分析的步骤；
8.根据权利要求7所述快速筛选及分析人参中DPP4酶抑制剂的方法，其特征在于，所述LC-MS分析步骤中，色谱条件包括：
9.根据权利要求7或8所述快速筛选及分析人参中DPP4酶抑制剂的方法，其特征在于，所述LC-MS分析步骤中，采用配有加热的ESI源的高分辨质谱仪用于数据的检测，采用负离子模式，参数如下：
10.权利要求1-6任一项所述快速筛选及分析中药中DPP4酶抑制剂的方法或者权利要求7-9任一项所述快速筛选及分析人参中DPP4酶抑制剂的方法在药物筛选及分析领域的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种快速筛选及分析中药中dpp4酶抑制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述快速筛选及分析中药中dpp4酶抑制剂的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述缓冲液包括tris-hcl缓冲液；
3.根据权利要求1或2所述快速筛选及分析中药中dpp4酶抑制剂的方法，其特征在于，所述步骤(2)中：
4.根据权利要求1-3任一项所述快速筛选及分析中药中dpp4酶抑制剂的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，还包括分别将所述样品液和空白液的解离液吹干后，收集残留物并加入定容溶剂进行复溶的步骤，分别得到所述样品液的分析样本和所述空白液的空白样本；
5.根据权利要求1-4任一项所述快速筛选及分析中药中dpp4酶抑制剂的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述数据统计分析步骤通过将获得的质谱数据中的所有化合物进行提取，进而获得每个化合物的分子量、保留时间以及峰面积信息；
6.根据权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：王洪平，牛楠，林兆洲，范春兰，尹琼，彭平，
申请(专利权)人：北京同仁堂股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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