【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物病原菌检测，具体属于一种烟草棒孢霉叶斑病菌的raa-lfd快速检测引物探针组合、试纸条及其应用。
技术介绍
1、由多主棒孢(corynespora cassicola)引起的烟草棒孢霉叶斑病首次于1973年在尼日利亚发现(lucas，1975)。病斑初期呈暗绿色至暗褐色小点，之后成浅褐色至褐色小圆斑，多个零散的小斑点可联合成不规则的大病斑，有轮纹，常有明显的黄色晕圈。近年来由多主棒孢引起的烟草棒孢霉叶斑病在广西烟区也愈发严重，是发生面积最广的真菌性叶部病害。但由于烟草叶部病害种类繁多，很多病害症状相似，而相关病害的快速检测研究相对滞后，难以做好病害的快速诊断和监测工作，可能造成未对症防治或防治滞后，影响防治效果。
2、目前已开发了多种针对多主棒孢的检测方法，如巢式pcr、real-time pcr和lamp检测等。巢式pcr最大的优点是可检测及其微量的dna，在多种检测方法中灵敏度最高，但需要经过两轮pcr扩增，耗时长。real-time pcr技术具有准确、灵敏度高的优点，同时可实现对多主棒孢的定量检测，但该技术要求昂贵的仪器设备，且整个检测流程需要2-3h。lamp检测技术可在65℃恒温1h完成检测，不要需要复杂的仪器设备，但需要设计4条引物，难度较大。因此，建立烟草棒孢霉叶斑病菌准确、高效且对设备要求低的检测技术具有重要的实用价值。
3、重组酶介导等温核酸扩增技术(recombinase aided amplification，raa)，简称raa技术。其原理与重组酶聚合酶扩增技术
4、raa产物的检测方法一般有3种：凝胶电泳检测、实时荧光定量检测和侧向流试纸条检测。其中测流层析试纸条(lateral flow dpstick，lfd)检测结合了抗原抗体杂交、分子杂交、胶体金标记以及侧向流层析技术。该检测方式需要设计一条长约50bp的探针，探针的5'端用荧光基团fam标记，3'端也需要用阻塞基团进行修饰，距离5'端30-35bp的位置同样设计一个脱碱基位点供核酸外切酶识别。探针与靶序列结合后，形成5'端被荧光基团标记，3'端被生物素标记的扩增产物。fam标记的探针与fam抗体金标物结合形成免疫复合物，该复合物通过层析扩散，生物素标记的扩增产物被试纸条检测线上的生物素配体识别并形成检测线，不被识别的复合物继续扩散到质控线，被质控线上的抗体识别形成质控线。该方法特异性强，不需要专业的仪器设备，检测时间短，5min内可通过肉眼观察获得结果。
5、在缩短检测周期和降低反应温度的条件下，该方法依然可以保持较高的灵敏度和较强的特异性，因此raa或rpa技术的应用研究也越来越多。目前已经开发了针对病毒、真菌、细菌等多种病原菌的rpa检测方法。在烟草病害检测方面，也已开展了基于rpa检测技术的研究。li等(2021)建立了rpa-lfd快速检测青枯菌的方法，其灵敏度与常规pcr相同，可以从102cfu/g浓度人工接种的烟草茎干和103cfu/g浓度接种的土壤中检测出青枯菌，此外，对于烟草根腐线虫、烟草黑胫病菌、烟草的辣椒脉斑驳病毒等，也相继有rpa检测方法的报道。但目前对烟草棒孢霉叶斑病菌尚未开展相关研究。
6、公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种烟草棒孢霉叶斑病菌的raa-lfd快速检测引物探针组合、试纸条及其应用。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：
3、本专利技术的第一个目的在于提供一种引物探针组合，所述引物探针组合物包括引物对和探针，其中，所述引物对为cc-177f与cc-473r，其序列如seq id no.1和seq id no.2所示；所述探针为cc-p，其序列如seq id no.3所示。
4、更为具体的，所述引物cc-473r的5'端用生物素biotin修饰；所述探针cc-p的5'端用6-羧基荧光素修饰，3'用阻塞基团c3 dspacer修饰，第33个碱基g用引地高辛idsp替换。
5、本专利技术的第二个目的在于提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括所述引物探针组合。
6、本专利技术的第三个目的在于提供一种检测试纸条，所述检测试纸条用于检测所述检测试剂盒扩增得到的产物；所述检测试纸条包括检测线和质控线。
7、本专利技术的第四个目的在于提供所述检测试纸条的使用方法，具体为：以检测样品中提取的dna为模板，使用所述检测试剂盒对其进行扩增；用所述检测试纸条对扩增产物进行可视化判读；其中，结果判定标准为：若只出现质控线则为阴性；若同时出现质控线和检测线为阳性。
8、更为具体的，扩增的反应条件为37℃恒温扩增。
9、本专利技术的第五个目的在于提供所述的引物探针组合、或所述的检测试剂盒、或所述的检测试纸条、或所述的检测试纸条使用方法在可视化检测烟草棒孢霉叶斑病菌中的应用。
10、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
11、本专利技术以烟草棒孢霉叶斑病菌its序列为靶标，设计raa引物对cc-177f与cc-473r，以及raa探针cc-p，建立了烟草棒孢霉叶斑病菌的raa-lfd快速检测体系，该体系在37℃恒温反应，检测极限为1pg/μl，结合peg-naoh溶液粗提病叶组织中dna，能在30min内获得可视化检测结果，比常规pcr检测更加灵敏，可为烟草棒孢霉叶斑病及多主棒孢引起的其他病害的田间快速诊断提供了新的方法。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合物包括引物对和探针，其中，所述引物对为Cc-177F与Cc-473R，其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述探针为Cc-P，其序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求所述的引物探针组合，其特征在于，所述引物Cc-473R的5'端用生物素Biotin修饰；所述探针Cc-P的5'端用6-羧基荧光素修饰，3'用阻塞基团C3 dSpacer修饰，第33个碱基G用引地高辛idSp替换。
3.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1所述的引物探针组合。
4.一种检测试纸条，其特征在于，所述检测试纸条用于检测权利要求3所述检测试剂盒扩增得到的产物；所述检测试纸条包括检测线和质控线。
5.一种权利要求4所述检测试纸条的使用方法，其特征在于，具体为：以检测样品中提取的DNA为模板，使用权利要求3所述检测试剂盒对其进行扩增；用所述检测试纸条对扩增产物进行可视化判读；其中，结果判定标准为：若只出现质控线则为阴性；若同时出现质控线和检测线为阳性。
...【技术特征摘要】
1.一种引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合物包括引物对和探针，其中，所述引物对为cc-177f与cc-473r，其序列如seq id no.1和seq id no.2所示；所述探针为cc-p，其序列如seq id no.3所示。
2.根据权利要求所述的引物探针组合，其特征在于，所述引物cc-473r的5'端用生物素biotin修饰；所述探针cc-p的5'端用6-羧基荧光素修饰，3'用阻塞基团c3 dspacer修饰，第33个碱基g用引地高辛idsp替换。
3.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1所述的引物探针组合。
4.一种检测试纸条，其特征在于，所述检测试纸条用于检测权利...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。