【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种制备人源抗体的方法
技术介绍
1、抗体药是目前快速增长且最先进、有效的一类药物，单克隆抗体技术的问世，则使研究和生产抗体药物成为现实。经过三十多年的发展，治疗性单克隆抗体药物现已成为生物医药的最重要组成部分之一，在疾病治疗上具有广阔的应用前景，成功用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等多种疾病。自1975年首个治疗性单克隆抗体获批以来，至今已有100多个单克隆抗体获批上市，近年来处于快速增长趋势。
2、最早的治疗性抗体是完全动物来源的，其免疫原性会导致人体产生抗抗体(humananti-mouse antibodies,hama)，甚至导致严重的过敏等副作用。通过抗体工程将动物来源的抗体人源化，可以降低免疫原性，但该过程需要耗费巨大的成本及时间，且难以完全消除免疫原性又保持高亲和力。解决办法便是开发全人源抗体，目前主要有四种方法：a)展示技术；b)转基因小鼠免疫筛选；c)人类b细胞永生化；d)人类记忆b细胞单细胞筛选。其中，“展示技术”该技术可高通量快速筛选抗体，但是，因筛选过程为纯人工体外系统，获得的抗体多样性及亲和能力有限，且存在非天然结构，仍然会有免疫原性，仍需花费大量时间和成本进行优化改造。人类b细胞只能从已经接触过抗原且有免疫响应的人类分离，由于来源限制，使用人类b细胞的筛选方法能够获得的抗体种类少，且筛选到高亲和力抗体的概率非常低。与其他方法相比，转入人类抗体编码基因的基因修饰小鼠模型优势明显，携带完整人类抗体可变区编码基因(>3mb)的小鼠
3、携带人类抗体编码基因的小鼠可以拥有健全的免疫系统，使用靶抗原进行免疫就可以产生由人类基因编码的高亲和力抗体。极大地简化了治疗性抗体发现的技术流程，省去了抗体工程化改造(如人源化、亲和力提升)的时间和成本。
4、然而，小鼠与人类的蛋白存在着较高的同源性，以claudin-18为例，人与鼠的claudin-18氨基酸同源性为88％，有些蛋白的人鼠同源性可达95％以上。b细胞成熟过程存在“阴性选择”过程，将识别机体自身蛋白的b细胞克隆清除。这种阴性选择机制将导致小鼠难以针对蛋白的人鼠同源区产生抗体，成为获得人类靶点抗体的一大阻碍。为了克服这个困难，现有技术将携带人源抗体编码基因的小鼠自身编码靶抗原的基因敲除，获得敲除纯合子的转基因小鼠用于免疫。这种方法虽然可以获得针对同源抗原(序列保守区)的抗体，但是需要针对每个靶抗原制作一个基因敲除品系，耗费大量的时间。此外，当需要制备与免疫系统功能相关的靶点(靶抗原)的抗体时，敲除小鼠自身编码靶抗原的基因可能会影响小鼠免疫系统的发育和功能，进而无法通过免疫反应获得相应的抗体。
5、此外，由于免疫过程在转基因(或转基因+敲除)鼠体内完成，需要获得活体动物才能开展实验。受限于政策及检疫等相关要求，活体动物运输的时间较长且费用昂贵，这也提高了转基因活体动物的可及性，给使用转基因小鼠进行抗体筛选带来了困难。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种新的制备人源抗体的方法，向免疫抑制的动物体内移植入携带有一种或多种人类免疫球蛋白可变区基因片段的供体转基因动物的干细胞，以重建受体动物的免疫系统。免疫系统重建成功的受体动物在经抗原免疫之后，利用供体来源的免疫细胞产生抗体，以解决现有技术下，制备人源抗体时使用的活体转基因动物受限于政策及检疫等相关要求，运输时间较长且费用昂贵的问题。供体来源的免疫细胞可以新鲜移植，也可以冻存及复苏，且便于远距离运输，可以将冻存的供体免疫细胞(而非活体动物)复苏并移植至受体小鼠重建免疫系统，并通过免疫以产生抗体，避免了活体动物的运输困难。
2、本专利技术所述方法在制备转基因动物与人类靶抗原存在较高同源性的抗体时，可使用靶抗原编码基因敲除的免疫抑制的动物作为移植受体，解决现有技术下转基因动物难以对人与转基因动物靶抗原同源区域产生抗体的问题。
3、本专利技术具体技术方案如下：
4、一种制备抗体的方法，使用抗原免疫受体动物并获得可结合该抗原的抗体，所述受体动物为移植入具有分化潜能的干细胞的免疫系统重建的动物，所述具有分化潜能的干细胞来源于携带有一种或多种人类免疫球蛋白可变区基因片段的供体动物。
5、优选的，所述人类免疫球蛋白选自igg，igm，iga，igd，ige中的一种或几种，所述可变区为vhdhjh重组或/和vkjk重组或vljl重组形成的基因片段所编码的区域中的一种或几种。优选的，可变区编码片段由jh1、jh1p、jh2、jh2p、jh3、jh3p、jh4、jh5或jh6中的一种参与重组形成。优选的，可变区编码片段由jk1、jk2、jk3、jk4或jk5中的一种参与重组形成。
6、本专利技术所述的抗体为能够特异性识别、并结合靶抗原的人源抗体。
7、所述靶抗原可以为人工合成、重组表达或天然存在于自然界中的分子或化合物。
8、所述靶抗原可以为包含3个以上氨基酸的多肽链。
9、所述靶抗原可以为膜受体或游离的蛋白。
10、所述人源抗体可以为靶向特定疾病相关治疗靶点的诊断、检测或治疗性抗体，优选为治疗性抗体。
11、所述人源抗体可以为可变区为人类基因编码的抗体，优选为治疗性抗体，如治疗肿瘤、自身免疫病、代谢病、神经系统疾病等人类疾病的治疗性抗体。
12、上述方法中，移植的供体和受体动物为可以为相同遗传背景，也可以为不同遗传背景。所述具有分化潜能的干细胞为能够分化为多种免疫细胞的干细胞，进一步可以为骨髓细胞、胎肝细胞、造血干细胞、多能干细胞、诱导性多能干细胞中的一种或几种，优选为骨髓细胞或造血干细胞。所述干细胞可以为新分离的细胞或冷冻后复苏的细胞。
13、上述方法中，移植的供体和受体动物为非人哺乳类或啮齿类动物。选自大鼠、小鼠、兔、羊、非人灵长类动物。本专利技术一个示例移植的供体和受体动物为小鼠。
14、本专利技术所述的方法，所述免疫抑制的受体动物为采用骨髓清除、使用低毒性药物进行免疫抑制和免疫调节、通过基因修饰使受体免疫系统缺陷或受到抑制中的一种或几种手段获得免疫抑制的受体动物。
15、所述骨髓清除为采用亚致死剂量的电离辐照或化学手段清除动物骨髓中的造血干细胞；所述使用低毒性药物为使用抑制干细胞增殖或阻断分化信息传导的药物(如imatinib等)进行免疫抑制和免疫调节；所述通过基因修饰使受体免疫系统缺陷或受本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种制备抗体的方法，其特征在于使用抗原免疫受体动物并获得可结合该抗原的抗体，所述受体动物为移植入具有分化潜能的干细胞的免疫系统重建的动物，所述具有分化潜能的干细胞来源于携带有一种或多种人类免疫球蛋白可变区基因片段的供体动物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述具有分化潜能的干细胞为骨髓细胞、胎肝细胞、造血干细胞、多能干细胞、诱导性多能干细胞中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述免疫系统重建为采用骨髓干细胞清除、使用低毒性药物进行免疫抑制和免疫调节、通过基因修饰中的一种或几种手段使受体动物免疫系统缺陷或受到抑制，并将具有分化潜能的干细胞移植到所述受体动物体内。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述骨髓清除为采用亚致死剂量的电离辐照或化学手段清除动物骨髓中的造血干细胞；所述低毒性药物为抑制干细胞增殖或阻断分化信息传导的药物；所述通过基因修饰使受体免疫系统缺陷或受到抑制为造血干细胞发育、分化缺陷或多种免疫细胞发育缺陷。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述电离辐照为X射线或Co60射线
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述受体动物为非人哺乳类或啮齿类动物。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述受体动物选自大鼠、小鼠、兔、羊、驼类、非人灵长类动物。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述受体动物为野生型或携带非天然内源基因的动物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述携带非天然内源基因的动物为靶抗原编码基因敲除的动物。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于包括如下步骤：
11.一种人源抗体，其特征在于采用权利要求1-10任一项所述的方法制备而成。
12.一种药物组合物，其特征在于包含权利要求11所述的人源抗体。
...【技术特征摘要】
1.一种制备抗体的方法，其特征在于使用抗原免疫受体动物并获得可结合该抗原的抗体，所述受体动物为移植入具有分化潜能的干细胞的免疫系统重建的动物，所述具有分化潜能的干细胞来源于携带有一种或多种人类免疫球蛋白可变区基因片段的供体动物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述具有分化潜能的干细胞为骨髓细胞、胎肝细胞、造血干细胞、多能干细胞、诱导性多能干细胞中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述免疫系统重建为采用骨髓干细胞清除、使用低毒性药物进行免疫抑制和免疫调节、通过基因修饰中的一种或几种手段使受体动物免疫系统缺陷或受到抑制，并将具有分化潜能的干细胞移植到所述受体动物体内。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述骨髓清除为采用亚致死剂量的电离辐照或化学手段清除动物骨髓中的造血干细胞；所述低毒性药物为抑制干细胞增殖或阻断分化信息传导的药物；所述通过基因修饰使受体免疫系统缺陷或受到抑制为造血干...
【专利技术属性】
技术研发人员：张明坤，彭俊超，李松，琚存祥，高翔，赵静，
申请(专利权)人：纽迈生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：
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