【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及一种表达盒、含其的基因工程菌及其在l-赖氨酸生产中的应用。
技术介绍
1、赖氨酸(lysine)又名2,6-二氨基己酸，属于碱性氨基酸。赖氨酸具有重要的营养生理功能，在医药、食品和饲料工业中应用广泛。同时，其也可作为前体物质用于合成尼龙聚合材料。赖氨酸的生产途径主要包括蛋白水解法、化学合成法以及发酵法三种，其中，微生物发酵法具有生产成本低、生产强度高、特异性高、环境污染小等特点，成为赖氨酸工业化生产应用最广的方法。
2、用于生产赖氨酸的原核微生物主要包括棒杆菌、短杆菌、诺卡氏菌、假单胞菌、埃希氏菌、芽孢杆菌等。谷氨酸棒杆菌(c.glutamicum)是发酵生产氨基酸最为重要和安全的菌株，通过代谢改造提高它过量合成各种氨基酸的能力一直是研究热点。例如，过表达赖氨酸合成途径的相关基因和反馈抑制脱敏的相关基因，或者从葡萄糖代谢开始的能量供应途径强化以及优化细胞膜上赖氨酸转运蛋白等都有效提高了赖氨酸的生产率。
3、除了不断加强生成赖氨酸的代谢途径，打开非赖氨酸代谢的其他旁路的发酵方法，也值得深入挖掘。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)是细胞代谢中最重要的氧化还原载体，被认为是重要辅因子，其不仅作为催化底物分解代谢的电子受体，也为能量依赖型的氧化还原反应提供还原力，是多种代谢产物(包括赖氨酸)合成中的主要驱动力。现阶段有一些研究通过甘油醛3-磷酸脱氢酶调控nadph提高赖氨酸产量，但是尚无从优化选育该酶以期高效生产赖氨酸的报道。
技术实现思路b>
1、为解决现有技术中l-氨基酸产量不高的问题，本专利技术提供一种用于制备l-赖氨酸的表达盒、基因工程菌及其应用。具体而言，本专利技术提供了一种含nadp依赖型甘油醛3-磷酸脱氢酶的表达盒及包含该表达盒的基因工程菌，所述基因工程菌可以在秸秆水解液中有效利用秸秆中的葡萄糖。本专利技术筛选到多功能甘油醛3-磷酸脱氢酶，通过调控胞内辅因子供应以及酰基辅酶a代谢角度，显著提高l-赖氨酸产量。
2、为解决上述技术问题，本专利技术第一方面提供一种表达盒，所述表达盒包含以下组件：nadp依赖型的甘油醛3-磷酸脱氢酶编码基因，其核苷酸序列分别如seq id no:1～5所示。
3、本专利技术第二方面提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包括本专利技术第一方面所述的表达盒，或包括本专利技术第一方面所述定义的核苷酸序列。
4、在某一较佳实施方案中，所述重组表达载体的骨架质粒为pk18mob。
5、所述pk18mob的具体信息可参考如下网页：
6、http://www.biovector.net/product/1089.html。
7、本专利技术第三方面提供一种基因工程菌，其为在出发菌中转入如本专利技术第一方面所述的表达盒，或如本专利技术第一方面所定义的核苷酸序列，或如本专利技术第二方面所述的重组表达载体。
8、所述基因工程菌中，所述出发菌为谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)，例如c.glutamicum b253或c.glutamicum caths141。
9、所述基因工程菌中，所述表达盒较佳地通过同源重组方式整合在所述出发菌的基因组中，或以非整合形式存在于所述出发菌中。
10、所述基因工程菌中，优选不表达出发菌株甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapdh)，例如其基因gapdh(ncbi geneid为cp025533.1)被敲除。
11、在某一较佳实施方案中，所述表达盒整合至所述gapdh基因的位点上。
12、本专利技术所述的出发菌可为野生型菌株，也可为经修饰的菌株。
13、本专利技术第四方面提供一种制备l-赖氨酸的方法，所述方法包括发酵培养如本专利技术第三方面所述的基因工程菌，和从发酵培养的培养液中回收l-赖氨酸。
14、在某一较佳实施方案中，所述发酵培养在适合所述基因工程菌生长的发酵培养基中进行。
15、在某一较佳实施方案中，所述发酵培养基含有不低于25g/l的葡萄糖，例如80-150g/l的葡萄糖。除葡萄糖外，发酵培养基中还含有供所述基因工程菌生长、繁殖或合成l-赖氨酸的其他成分，例如磷酸二氢钾，和/或，尿素，和/或，硫酸镁，和/或，甲硫氨酸，和/或，玉米浆，和/或酵母膏。
16、在某一较佳实施方案中，所述发酵的温度为28～37℃，例如35℃。
17、在某一较佳实施方案中，所述发酵的ph为6～8，例如7。
18、在某一较佳实施方案中，所述发酵培养基含有木质纤维素物料的水解液。
19、在某一较佳实施方案中，所述发酵培养基中的碳源来源于木质纤维素物料的水解液。所述碳源较佳为葡萄糖。
20、所述木质纤维素物料的水解液为木质纤维素物料的经酶解糖化后形成。所述酶解使用的是纤维素酶。
21、所述木质纤维素物料包括但不限于秸秆、稻草、稻壳、蔗渣、木材、木屑中的至少一种。所述秸秆优选包括玉米秸秆、小麦秸秆、棉花秸秆。
22、在某一较佳实施方案中，在所述酶解糖化前对所述木质纤维素物料进行预处理，所述预处理包括对木质纤维素物料进行筛分、除杂、干酸预处理和/或脱毒处理。
23、在一些具体实施方案中，所述木质纤维素物料的粒径为2-20mm，例如5mm、10mm。
24、本专利技术第五方面提供一种如本专利技术第一方面所述的表达盒、如本专利技术第一方面所述定义的核苷酸序列、如本专利技术第二方面所述的重组表达载体、或如本专利技术第三方面所述的基因工程菌在制备l-赖氨酸中的应用。
25、本专利技术第六方面提供本专利技术第一方面所述的表达盒和本专利技术第二方面所述的重组表达载体在制备谷氨酸棒杆菌工程菌中的应用。
26、本专利技术第七方面提供一种基因工程菌的制备方法，其通过将如本专利技术所述的表达盒导入如本专利技术中所定义的出发菌中获得所述基因工程菌。
27、所述制备方法较佳地进一步包括：阻断所述基因工程菌中乳酸脱氢酶的表达，例如敲除gapdh基因。
28、所述制备方法中，较佳地，所述表达盒整合至所述gapdh基因的位点。
29、在某一较佳实施方案中，本专利技术所述的出发菌为c.glutamicum caths141，其保藏号为cctcc no:m 20211495。
30、在某一较佳实施方案中，本专利技术所述的出发菌为c.glutamicum b253，购买自上海工业微生物所。
31、本专利技术所述的nadp依赖型的甘油醛3-磷酸脱氢酶分别来自clostridium sp.nj4，chryseobacterium joostei，streptococcus mutans serotype c，chryseobacteriumpiscicola和pedobacter alluvionis菌种，其核苷酸序列分别如seq id no:1～5所示。
32、本专利技术所述的出发菌可为野生型菌株，也本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基因表达盒，其特征在于，所述基因表达盒包括NADP依赖型的甘油醛3-磷酸脱氢酶编码基因，所述NADP依赖型的甘油醛3-磷酸脱氢酶编码基因的核苷酸序列分别如SEQID NO:1～5所示。
2.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括如权利要求1所述的基因表达盒。
3.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的骨架质粒为pK18mob。
4.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌包含如权利要求1所述的基因表达盒或权利要求2或3所述的重组表达载体；所述基因工程菌的出发菌为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)；
5.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述的谷氨酸棒杆菌为C.glutamicumB253或保藏编号为CCTCC NO:M 20211495的C.glutamicum CathS141；
6.一种生产L-赖氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括发酵培养如权利要求4或5所述的谷氨酸棒杆菌工程菌，和从发酵培养的培养液中回收L-赖氨酸。
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