【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物材料，具体涉及一种负载姜黄素和mir140的靶向杂交外泌体、制备方法及应用。
技术介绍
1、骨关节炎oa是一种特征为软骨进行性退变的退行性慢性关节病，oa发病机制目前尚未完全阐明，也没有彻底治愈oa和抑制oa进展的有效的方法，由于关节软骨缺乏提供营养的血管并且是高度分化的组织，关节软骨自身修复能力有限，目前治疗方法多针对于疼痛管理和关节置换手术。随着对oa发病机制以及关节软骨组织损伤机制的了解，新的治疗靶点不断出现，oa治疗方式从缓解疾病症状转而提升为减缓和阻止oa进展，关节软骨中唯一的细胞是软骨细胞，正常状态下可合成细胞外基质ecm来维持软骨稳态，在维持软骨结构和功能的完整性上起关键作用。
2、目前有研究证明姜黄素对oa的治疗有一定的效果，但是姜黄素对细胞的毒性较大，并不适用于直接使用，目前还没有很好的减毒措施，限制了其使用。使用脂质体来负载姜黄素是通过将姜黄素颗粒包裹在脂质体颗粒表面的双分子层中，形成球状或类球状载体。这种方法虽然在一定程度上提高了姜黄素分散程度、延长药物作用时间、增加生物相容性。但也存在如下的缺点，研究表明脂质体的靶向性主要集中在脾脏，肝脏，肾脏等器官，这些器官含有大量网状细胞，其他器官则表现出靶向不明确的特点。使用外泌体负载姜黄素，一般是通过孵育法，其药物装载率低，递送效率差。限制了姜黄素在骨关节炎治疗领域的使用。
技术实现思路
1、本专利技术针对现有技术存在的问题提供一种负载姜黄素和mir140的靶向杂交外泌体、制备方法及应用
2、本专利技术采用的技术方案是：
3、一种负载姜黄素和mir140的靶向杂交外泌体的制备方法，包括以下步骤：
4、步骤1：获取可稳定表达软骨细胞靶向肽的细胞株；
5、步骤2：步骤1得到的细胞株培养后，加入mir-140-5p agomir共培养，分离提取得到负载mir-140-5p的外泌体；
6、步骤3：大豆卵磷脂和胆固醇溶液中加入姜黄素溶液，旋蒸后加缓冲液超声，得到脂质体缓冲液；脂质体缓冲液中加入蔗糖，冻干后水合、过滤即可得到负载姜黄素的脂质体溶液；
7、步骤4：将步骤2得到的负载mir-140-5p的外泌体和步骤3得到的负载姜黄素的脂质体溶液通过冷冻循环法制备得到所需靶向杂交外泌体。
8、进一步的，所述步骤1中通过基因编辑器对应质粒cap，转染hek293细胞，采用抗生素筛选稳定表达质粒的细胞即可得到可稳定表达软骨细胞靶向肽的细胞株。
9、进一步的，所述步骤2中步骤1得到的细胞株长满前加入mir-140-5p agomir共培养24 h～48 h，收集上清，分离提取即可得到负载mir-140-5p的外泌体。
10、进一步的，所述步骤3中大豆卵磷脂和胆固醇的质量比为1～10:1，姜黄素与胆固醇的质量比为1～2:1000～25。
11、进一步的，所述步骤4中负载mir-140-5p的外泌体和负载姜黄素的脂质体的颗粒数比值为1~10：10~1。
12、进一步的，所述步骤4中制备过程如下：
13、将负载mir-140-5p的外泌体和负载姜黄素的脂质体混合孵育，在液氮中冷冻30min，37 ℃摇床上放置5 min以上，重复操作n次即可得到所需靶向杂交外泌体。
14、进一步的，所述步骤3中分离提取过程如下：
15、取上清液，300 g，离心5 min～10 min；
16、取上清液，10000 g，在4 ℃条件下，离心30 min以上；
17、去上清液，120000 g，在4 ℃条件下，离心60 min以上；
18、取沉淀，重悬，120000 g，在4 ℃条件下，离心60 min以上；
19、取沉淀，重悬，即可得到外泌体。
20、一种负载姜黄素和mir 140的靶向杂交外泌体，所述靶向杂交外泌体同时负载有姜黄素和mir-140-5p。
21、一种负载姜黄素和mir 140的靶向杂交外泌体的应用，所述靶向杂交外泌体在制备治疗骨关节炎药物中的应用。
22、本专利技术的有益效果是：
23、（1）本专利技术外泌体同时负载姜黄素和mir140，姜黄素和mir140协同可以抑制nf-κb通路的激活，增强抗炎效果；
24、（2）本专利技术外泌体同时负载姜黄素和mir140，联用可以显著降低姜黄素的细胞毒性，使得其能够满足临床的需要。
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1.一种负载姜黄素和miR140的靶向杂交外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种负载姜黄素和miR140的靶向杂交外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤1中通过具有软骨细胞特异性靶向肽序列的基因编辑器对应质粒CAP，转染HEK293细胞，采用抗生素筛选稳定表达质粒的细胞即可得到可稳定表达软骨细胞靶向肽的细胞株。
3.根据权利要求1所述的一种负载姜黄素和miR140的靶向杂交外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤2中步骤1得到的细胞株长满前加入miR-140-5p agomir共培养24 h～48 h，收集上清，分离提取即可得到负载miR-140-5p的外泌体。
4.根据权利要求1所述的一种负载姜黄素和miR140的靶向杂交外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤3中大豆卵磷脂和胆固醇的质量比为1～10:1，姜黄素与胆固醇的质量比为1～2:1000～25。
5.根据权利要求1所述的一种负载姜黄素和miR140的靶向杂交外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤4中负载miR-140-5p的外泌体和负载姜黄
6.根据权利要求5所述的一种负载姜黄素和miR140的靶向杂交外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤4中制备过程如下：
7.根据权利要求3所述的一种负载姜黄素和miR140的靶向杂交外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤3中分离提取过程如下：
8.如权利要求1～7任一所述制备方法得到的负载姜黄素和miR 140的靶向杂交外泌体，其特征在于，所述靶向杂交外泌体同时负载有姜黄素和miR-140-5p。
9.如权利要求8所述一种负载姜黄素和miR 140的靶向杂交外泌体的应用，其特征在于，所述靶向杂交外泌体在制备治疗骨关节炎药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种负载姜黄素和mir140的靶向杂交外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种负载姜黄素和mir140的靶向杂交外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤1中通过具有软骨细胞特异性靶向肽序列的基因编辑器对应质粒cap，转染hek293细胞，采用抗生素筛选稳定表达质粒的细胞即可得到可稳定表达软骨细胞靶向肽的细胞株。
3.根据权利要求1所述的一种负载姜黄素和mir140的靶向杂交外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤2中步骤1得到的细胞株长满前加入mir-140-5p agomir共培养24 h～48 h，收集上清，分离提取即可得到负载mir-140-5p的外泌体。
4.根据权利要求1所述的一种负载姜黄素和mir140的靶向杂交外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤3中大豆卵磷脂和胆固醇的质量比为1～10:1，姜黄素与胆固醇的质量比为1～...
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