【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于多肽去三氟乙酸盐的脱盐，尤其是涉及一种可以得到高活性高稳定型的全r系列多肽的脱盐方法。
技术介绍
1、精氨酸（arginine，简写:r），结构式如下：
2、，
3、精氨酸是氨基酸类化合物，为碱性氨基酸。白色菱形结晶或单斜片状结晶（无结晶水），无臭，味苦；易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚。
4、三氟乙酸(tfa，分子式:cf3cooh)，结构式如下：
5、，
6、别名三氟醋酸，无色挥发性发烟液体，有吸湿性和刺激性臭味。与水、氟代烃、甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、苯、四氯化碳、己烷混溶，是蛋白质和聚酯的优良溶剂。三氟乙酸(tfa)是一种强羧酸，有轻微的毒性。在多肽固相合成过程中，三氟乙酸（tfa）经常被用来将多肽从固相树脂上切割下来。在反相hplc纯化多肽的过程中，也会用到三氟乙酸或醋酸。但如果是用于临床前和临床研究中的多肽，残留的三氟乙酸或氟化物因有毒的而无法被使用。
7、由固相合成的全精氨酸(r)组成的多肽，在经过高浓度tfa切割试剂，把全r系列多肽从树脂上切割下来，精氨酸上的胍基基团很容易与tfa反应结合上去。且精氨酸是一种亲水性氨基酸，全精氨酸系列多肽亲水性很强，极性很大。经过液相制备时，被含有tfa作为离子对试剂的制备流动相洗脱分离之后，全精氨酸系列多肽极易富集三氟乙酸，造成全r系列多肽纯品中，三氟乙酸盐的含量极高，甚至高达60%之多。过高的三氟乙酸盐使得全r系列多肽的有效含量低，多肽的活性也会大大降低。高三氟乙酸盐对于后续很多生物实验、动物
8、现有脱盐技术由采用反相色谱，水洗脱tfa，或是加入有机碱中和三氟乙酸盐，在洗掉有机盐，这两种办法对于全r系列多肽去三氟乙酸盐效果都很差。第一种反相色谱法，由于全r系列多肽的强极性和亲水性，很难完全洗脱，且损失率很高。第二种有机碱中和法不仅不好控制ph值，而且有机盐也是极溶于水，很难轻易洗脱干净酸碱中和的有机盐。本专利技术
9、采用两步脱盐方法，有引入新型二氧化钛（tio2）材料对三氟乙酸进行吸附达到去除三氟乙酸盐的目的，再变结合形式的三氟乙酸盐为游离形式，采用阴离子树脂与二氧化钛（tio2）材料的混合使用，降低甚至完全去除全r系列多肽中的结合型和游离型三氟乙酸盐。最终得到活性更高、更稳定的全r系列多肽产品。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一条固相合成的全r系列多肽三氟乙酸盐的脱盐方法，主要解决现有脱盐方法存在的脱盐难度高及效率差的技术问题。
2、为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：
3、一种固相合成的全r系列多肽三氟乙酸盐的脱盐方法，包括如下步骤：
4、1）先把固相合成出来的全r系列多肽粗品，用反相高效液相色谱法纯化分离，得到所要求纯度的全r系列多肽产物制备液，此时制备液中不仅含有游离三氟乙酸盐，也含有结合三氟乙酸盐；
5、2）按照制备液体积比例装填二氧化钛（tio2）于层析柱内，并用乙醇作为淋洗剂，淋洗干净之后，待用；
6、3）第一步脱游离的三氟乙酸盐，把纯化之后所得的制备液过淋洗干净之后的二氧化钛（tio2）层析柱，脱除制备液中的三氟乙酸盐；
7、4）对第一步脱盐之后的制备液进行水浴40℃旋蒸、冷冻、真空干燥，得到全r系列多肽固体中间体；
8、5）利用离子色谱仪，检测全r系列多肽固体中间体此时三氟乙酸根含量；
9、6）将全r系列多肽固体中间体溶解于二甲亚砜（dmso）中，置于搅拌器上，充分溶解，并逐步加入三乙胺，搅拌反应，脱去r胍基上结合的三氟乙酸盐，使得结合形式的三氟乙酸盐转成游离的三氟乙酸缓冲盐；
10、7）装填上层为强碱性阴离子树脂，下层为二氧化钛（tio2）混合的层析柱，并用乙醇淋洗干净，待用；
11、8) 将新产生游离的三氟乙酸缓冲盐多肽中间液过淋洗干净的混合层析柱，增加柱温箱，温度设置45℃，脱去新产生的三氟乙酸缓冲盐，得到全r系列多肽液；
12、9) 对第二步脱盐后的全r系列多肽液加入甲醇进行稀释，水浴42℃旋蒸，去除全r系列多肽液中的dmso试剂，得到全r系列多肽中间液；
13、10) 再对此全r系列多肽中间液进行纯水稀释、冷冻、真空干燥，得到固体粉末状的全r系列多肽终产品；
14、11）对全r系列多肽终产品用离子色谱仪检测tfa根含量，小于1%。
15、优选的方案是：所述的步骤2）乙醇淋洗速度为450-600滴/分钟。
16、优选的方案是：所述的步骤3）制备液淋洗速度为240-300滴/分钟。
17、优选的方案是：所述的步骤6）搅拌器温度为45℃。
18、优选的方案是：所述的步骤6）三乙胺的加入量为dmso重量的8-10‰。
19、优选的方案是：所述的步骤6）反应时间为3-7h。
20、优选的方案是：所述的步骤7）强碱性的阴离子树脂和二氧化钛（tio2）混合重量比例为7:5。
21、优选的方案是：所述的步骤9）加入甲醇与dmso的体积比为4:1。
22、优选的方案是：所述的步骤10）纯水稀释比例为旋蒸之后液体的7-9倍。
23、本专利技术的有益效果是：针对固相合成的全r系列多肽高三氟乙酸盐很难去除的问题提出解决方案，本专利技术的方法可以更有效的去除全r系列多肽中的三氟乙酸盐。根据多肽产品中三氟乙酸盐的存在形式，分步骤、分方法实施脱盐。第一步引入二氧化钛（tio2）为填料的层析柱，二氧化钛（tio2）可以吸附三氟乙酸，同时二氧化钛（tio2）也不溶于水，经过反相高效液相色谱法得出全r系列多肽的制备液完全可以作为淋洗剂，以240-300滴/分钟的速度进行吸附洗脱。再往溶解在dmso中得多肽产品中，利用三乙胺反应变结合型三氟乙酸为游离型，温度45℃的设定不仅可以增大多肽在dmso中得溶解性、降低dmso的粘性，同时不会使得多肽变性，保证多肽的稳定性。再第二步脱盐，强碱性的阴离子树脂可以释放大量的oh-，当利用dmso与三乙胺脱结合三氟乙酸盐时，新形成三氟乙酸缓冲盐。此时游离盐中的h+更加活跃，与强碱性的阴离子树脂释放的oh-相互作用，再适时配比一定量的二氧化钛（tio2），达到去三氟乙酸缓冲盐的目的。使得全r系列多肽可以得到完全脱去三氟乙酸盐的效果。在本专利技术中，整个脱盐过程涉及到引入新型二氧化钛（tio2）、强碱性的阴离子树脂与二氧化钛（tio2）混合使用，来吸附去除三氟乙酸盐。外此，本专利技术中使用的试剂、仪器简单易得，操作成本低，既能达到完全去除全r型多肽高三氟乙酸盐的目的，又能为多肽脱盐技术提出了一种新思路、新方法。
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1.一种固相合成的全R系列多肽三氟乙酸盐的脱盐方法，其特征是，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种固相合成的全R系列多肽三氟乙酸盐的脱盐方法，其特征是：所述的步骤2）乙醇淋洗速度为450-600滴/分钟。
3.根据权利要求1所述的一种固相合成的全R系列多肽三氟乙酸盐的脱盐方法，其特征是：所述的步骤3）制备液洗脱速度为240-300滴/分钟。
4.根据权利要求1所述的一种固相合成的全R系列多肽三氟乙酸盐的脱盐方法，其特征是：所述的步骤6）中搅拌器，温度设定45℃。
5.根据权利要求1所述的一种固相合成的全R系列多肽三氟乙酸盐的脱盐方法，其特征是：所述的步骤6）逐步加入二甲亚砜重量8-10‰的三乙胺。
6.根据权利要求1所述的一种固相合成的全R系列多肽三氟乙酸盐的脱盐方法，其特征是：所述的步骤6）中，反应时间为3-7h。
7.根据权利要求1所述的一种固相合成的全R系列多肽三氟乙酸盐的脱盐方法，其特征是：所述的步骤7）中强碱性的阴离子树脂和二氧化钛混合比例为7:5。
8.根据权利要求1所述的一种
9.根据权利要求1所述的一种固相合成的全R系列多肽三氟乙酸盐的脱盐方法，其特征是：所述的步骤10）纯水稀释比例为旋蒸后混合液体量的7-9倍。
...【技术特征摘要】
1.一种固相合成的全r系列多肽三氟乙酸盐的脱盐方法，其特征是，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种固相合成的全r系列多肽三氟乙酸盐的脱盐方法，其特征是：所述的步骤2）乙醇淋洗速度为450-600滴/分钟。
3.根据权利要求1所述的一种固相合成的全r系列多肽三氟乙酸盐的脱盐方法，其特征是：所述的步骤3）制备液洗脱速度为240-300滴/分钟。
4.根据权利要求1所述的一种固相合成的全r系列多肽三氟乙酸盐的脱盐方法，其特征是：所述的步骤6）中搅拌器，温度设定45℃。
5.根据权利要求1所述的一种固相合成的全r系列多肽三氟乙酸盐的脱盐方法，其特征是：所述的步骤6）逐步加...
【专利技术属性】
技术研发人员：闫凤，李杨，姚伟，
申请(专利权)人：吉尔生化上海有限公司，
类型：发明
国别省市：
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