本发明专利技术属于基因检测领域，公开了一种蓝莓茎溃疡病菌的特异性检测靶标Da_6441，同时还公开了基于该检测靶标建立的PCR检测方法、荧光检测方法及侧流层析试纸条检测方法。首先，采用本发明专利技术提供的PCR检测引物针对Da_6441能够扩增出特异性条带，条带大小为475bp。其次，采用本发明专利技术提供的实时荧光PCR检测引物和探针针对Da_6441进行实时荧光检测，Ct值为25.95，为阳性。再次，本发明专利技术建立了快速、特异、灵敏、便携的基于侧流层析试纸条的检测方法，在常温下进行试纸条快速检测，同时，经过灵敏度实验显示，在含有0.56pg/μL的蓝莓茎溃疡病菌基因组DNA中产生明显的检测条带，说明蓝莓茎溃疡病菌(D.australafricana)检测靶标Da_6441的恒温侧流层析试纸条技术具有高灵敏度。因此，本发明专利技术建立了基于特异性检测靶标Da_6441蓝莓茎溃疡病菌全方位的检测方法，为蓝莓茎溃疡病菌的实验室及现场快速检测提供了灵敏、可靠的新方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因检测领域，具体涉及一种蓝莓茎溃疡病菌的特异性检测靶标及其应用。
技术介绍
1、蓝莓茎溃疡病菌(diaporthe australafricana)2012年首次在智利蓝莓上被发现，致病力强，在智力中部和南部的蓝莓种植园广泛发生，造成了严重的经济损失。除此，还在澳大利亚和南非的葡萄藤中被发现。蓝莓茎溃疡病菌(diaporthe australafricana)属于间座壳属(diaporthe spp.)植物病原真菌，寄主广泛，可侵染蓝莓、葡萄、苹果和梨，不仅能侵染植株的茎、叶及果实，引起植株枯萎、茎溃疡、叶斑、果腐、枯梢等症状，还能潜伏侵染，导致储藏期果实腐烂。d.australafricana病菌可通过雨水、果实及植物材料传播。中国目前还没有发生，一旦传入，将严重威胁我国果树产业的生态安全。
2、目前的分子鉴定技术主要采用its1/its4t或actf1/r1通用引物pcr并测序，需要专业技术人员以及专门的实验室仪器进行分子鉴定，还没有任何关于等温扩增技术检测蓝莓茎溃疡病菌的报道。its基因和actin基因是真菌的保守基因，同属不同种的真菌的its基因和actin基因差异小，而恒温扩增技术由于无扩增体系的热循环，仅靠酶和引物的作用来识别模板，引物设计比基于pcr的方法难，特异性差。
3、筛选特异性好的靶标基因是开发所有基于核酸的分子检测技术的核心，尤其对于建立灵敏、准确、快速的现场检测技术对于蓝莓茎溃疡病菌的早期诊断具有重要作用。
技术实现思路
1、针对目前现有技术中的不足，本专利技术提供了一种diaporthe australafricana的检测靶标da_6441，并基于此靶标建立了pcr检测方法、荧光检测方法及侧流层析试纸条检测方法。本专利技术建立的蓝莓茎溃疡病菌快速检测方法，通过特异性和灵敏度评价，为蓝莓茎溃疡病菌的现场快速检测提供一种灵敏、可靠的新方法。
2、为了实现上述之专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供了一种蓝莓茎溃疡病菌(d.australafricana)的特异性检测靶标da_6441，所述特异性检测靶标的核苷酸序列如seq id no:1所示。
4、第二方面，本专利技术还提供了一种第一方面所述的特异性检测靶标da_6441的pcr检测引物，所述pcr检测引物包括正向引物da-pcr-f和反向引物da-pcr-r。
5、进一步地，所述正向引物da-pcr-f和所述反向引物da-pcr-r的序列分别如seq idno:2和seq id no:3所示。
6、第三方面，本专利技术还提供了一种第一方面所述的特异性检测靶标da_6441的实时荧光pcr检测引物及探针组合，所述实时荧光pcr检测引物包括正向引物da-qpcr-f和反向引物da-qpcr-r。
7、进一步地，所述正向引物da-qpcr-f和所述反向引物da-qpcr-r的序列分别如seqid no:4和seq id no:5所示，所述探针da-qpcr-pb序列如seq id no:6所示。
8、进一步地，所述探针da-qpcr-pb的5'端连接有fam修饰，3'端连接有mgb修饰。
9、第四方面，本专利技术还提供了一种基于侧流层析试纸条技术检测第一方面所述的特异性检测靶标da_6441的引物及探针组合，所述引物包括正向引物da-rpa-f和反向引物da-rpa-r。
10、进一步地，所述正向引物da-rpa-f和所述反向引物da-rpa-r的序列分别如seq idno:7和seq id no:8所示，所述探针da-rpa-pb序列如seq id no:9所示。
11、进一步地，所述反向引物da-rpa-r的5'端连接有biotin修饰。
12、进一步地，所述探针da-rpa-pb的5'端连接有fam修饰，3'端连接有c3 space修饰，第33和34位核苷酸之间连接有dspacer。
13、第五方面，本专利技术还提供了一种检测蓝莓茎溃疡病菌(d.australafricana)的试剂盒，所述试剂盒包括第二方面所述的pcr检测引物、第三方面所述的实时荧光pcr检测引物及探针组合或第四方面所述的引物及探针组合。
14、进一步地，所述试剂盒还包括装有冻干酶混合物的反应单元管、缓冲液、引发剂、检测水和核酸检测试纸条。
15、第六方面，本专利技术还提供了第二方面所述的pcr检测引物、第三方面所述的实时荧光pcr检测引物及探针组合或第四方面所述的基于侧流层析试纸条技术的引物及探针组合、或第五方面所述的试剂盒在检测蓝莓茎溃疡病菌(d.australafricana)中的应用。
16、进一步地，所述的pcr检测引物在检测蓝莓茎溃疡病菌(d.australafricana)中的应用，具体为，
17、1)提取待测样本基因组dna，
18、2)采用第二方面所述的pcr检测引物或第五方面所述的试剂盒进行pcr扩增，当时扩增产物出现475bp的特异性条带，即为检测到蓝莓茎溃疡病菌(d.australafricana)。
19、进一步地，所述的基于侧流层析试纸条技术的引物及探针组合在检测蓝莓茎溃疡病菌(d.australafricana)中的应用，具体为，
20、1)提取待测样本基因组dna；
21、2)以所述基因组dna为模板，利用第四方面所述的引物及探针组合或第五方面所述的试剂盒进行rpa扩增；
22、3)应用侧流层析试纸条进行rpa扩增产物检测；当试纸条出现两条条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有蓝莓茎溃疡病菌；当试纸条只有质控区出现一条条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有蓝莓茎溃疡病菌。
23、本专利技术相对于现有技术而言，具有以下技术效果：
24、1)本专利技术提供了一个蓝莓茎溃疡病菌(d.australafricana)的高信赖度的特异性分子检测靶标da_6441，并基于新靶标建立灵敏、特异的分子检测方法，对发展蓝莓茎溃疡病菌所致病害早期诊断具有重要作用。
25、2)特异性好：针对蓝莓茎溃疡病菌(d.australafricana)的特异性分子检测靶标da_6441，设计普通pcr、实时荧光pcr和恒温扩增/侧流层析试纸条检测方法均可特异性检测d.australafricana。采用本专利技术提供的pcr检测引物检测多种植物病原真菌基因组dna，只有蓝莓茎溃疡病菌基因组dna扩增出475bp的特异性条带，与引物设计一致；采用本专利技术提供的实时荧光pcr检测引物和探针检测多种植物病原真菌基因组dna，只有检测蓝莓茎溃疡病菌基因组dna的实时荧光曲线ct值为25.95，小于35，为阳性；采用本专利技术提供的恒温扩增正反向引物和探针，并用侧流层析试纸条检测，只有蓝莓茎溃疡病菌基因组dna产生明显的检测条带。...
【技术保护点】
1.一种蓝莓茎溃疡病菌(Diaporthe australafricana)的特异性检测靶标Da_6441，其特征在于，所述特异性检测靶标的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
2.一种权利要求1所述的特异性检测靶标Da_6441的PCR检测引物组，其特征在于，所述PCR检测引物包括正向引物和反向引物，优选地，所述正向引物和所述反向引物的序列分别如SEQ ID No:2和SEQ ID No:3所示。
3.一种权利要求1所述的特异性检测靶标Da_6441的实时荧光PCR检测引物及探针组合，其特征在于，所述实时荧光PCR检测引物包括正向引物和反向引物，优选地，所述正向引物和所述反向引物的序列分别如SEQ ID No:4和SEQ ID No:5所示，所述探针引物序列如SEQ ID No:6所示，所述探针的5'端连接有FAM修饰，3'端连接有MGB修饰。
4.一种基于侧流层析试纸条技术检测权利要求1所述的特异性检测靶标Da_6441的引物及探针组合，其特征在于，所述引物包括正向引物和反向引物，优选地，所述正向引物和反向引物的序列分别如SEQ ID No:7和SEQ ID No:8所示，所述探针序列如SEQ ID No:9所示。
5.根据权利要求4所述的特异性检测靶标Da_6441的引物及探针组合，其特征在于，所述反向引物的5'端连接有Biotin修饰；所述探针的5'端连接有FAM修饰，3'端连接有C3Space修饰，第33和34位核苷酸之间连接有dSpacer。
6.一种检测蓝莓茎溃疡病菌(D.australafricana)的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的PCR检测引物、权利要求3所述的实时荧光PCR检测引物及探针组合或权利要求5所述的引物及探针组合。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求5所述的引物及探针组合，还包括装有冻干酶混合物的反应单元管、缓冲液、引发剂、检测水和核酸检测试纸条。
8.权利要求2所述的PCR检测引物、权利要求3所述的实时荧光PCR检测引物及探针组合、权利要求5所述的引物及探针组合、或权利要求6-7任一所述的试剂盒在检测蓝莓茎溃疡病菌(D.australafricana)中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，
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【技术特征摘要】
1.一种蓝莓茎溃疡病菌(diaporthe australafricana)的特异性检测靶标da_6441，其特征在于，所述特异性检测靶标的核苷酸序列如seq id no:1所示。
2.一种权利要求1所述的特异性检测靶标da_6441的pcr检测引物组，其特征在于，所述pcr检测引物包括正向引物和反向引物，优选地，所述正向引物和所述反向引物的序列分别如seq id no:2和seq id no:3所示。
3.一种权利要求1所述的特异性检测靶标da_6441的实时荧光pcr检测引物及探针组合，其特征在于，所述实时荧光pcr检测引物包括正向引物和反向引物，优选地，所述正向引物和所述反向引物的序列分别如seq id no:4和seq id no:5所示，所述探针引物序列如seq id no:6所示，所述探针的5'端连接有fam修饰，3'端连接有mgb修饰。
4.一种基于侧流层析试纸条技术检测权利要求1所述的特异性检测靶标da_6441的引物及探针组合，其特征在于，所述引物包括正向引物和反向引物，优选地，所述正向引物和反向引物的序列分别如seq id no:7和seq id no:8所示，所述探针...
【专利技术属性】
技术研发人员：李鑫，雷荣，李辉，姜锋，王新一，李茗乐，
申请(专利权)人：大连海关技术中心，
类型：发明
国别省市：
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