【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及一种构建用于异种输血的基因工程动物的方法。
技术介绍
1、随着科技的快速进步，现代战争中局部战争形态和武器种类发生了翻天覆地的变化，大量高爆、高能武器投入应用，杀伤力和破坏性显著提高，武器杀伤面积逐步扩大，导致四肢伤残的发生率显著上升，在海湾战争中四肢伤占战伤的百分之八十以上。战时严重穿透伤或爆震伤往往会引起致命的大出血，这类伤员病情危重、紧急，在治疗时受限于战场条件，很可能因血液制品供应不足，会很快出现出血性休克。尽管断肢再植技术已经能够适应临床需要，但从一线战场往后转运的过程中，肢体容易出现缺血性坏死，最终致残率极高。如何实现这部分肢体战创伤伤员的有效救治，提升战场以及后期伤员救治中的存活率、降低死亡及伤残率，是全世界军事医学中一个亟待解决的重要难题。本专利技术适应现代化战争需求，探索人源化基因修饰猪血液在肢体战伤救治中的应用，提高四肢战创伤救治水平，降低四肢战创伤截肢率及死亡率，具有重大意义。
2、此外，输血是抢救生命的重要措施之一，特别是在急性大出血、严重贫血和创伤手术时，患者急需补充新的血液维持生命。近年来，疫情肆虐全球，血液来源严重不足，血液制品一直处于供不应求的状态，多地血库告急。
3、将非人类动物的血液输给人类这一行为称为异种输血，研究发现，猪的红细胞(猪红细胞，简称prbcs)与人类的红细胞有着很相似的特征，包括细胞的大小以及细胞的寿命，prbcs可以在人体内正常存活。人源化基因修饰猪来源的红细胞不仅取材便利，也有利于实现血液制品的批量化生产，更能直接存储
4、但是，异种输血存在三大障碍：血型不相符、免疫排斥和病原微生物感染风险。猪的ao血型类似于人的abo血型系统，可以通过筛选o型猪保证血型系统相容。在猪红细胞进入人体后，因免疫排斥和凝集反应导致红细胞溶血。根据溶血反应发生部位的不同，可分为血管内溶血反应和血管外溶血反应，前者主要由猪红细胞表面异种抗原与人血清中天然抗体发生特异性结合，激活补体系统形成攻膜复合物导致红细胞裂解，后者由于人巨噬细胞表面sipα(signal regulatory protein-α)蛋白无法识别猪红细胞膜上的“自我”细胞信号cd47蛋白，引发巨噬细胞的吞噬作用。
5、转基因猪在很多领域已经得到应用，然而却依然受到一定的限制，转基因的效率与整合位点的不确定性是主要原因。crispr/cas系统，广泛存在于真细菌和古生菌中，是一个用来保护宿主不受病毒二次侵害的获得性免疫系统。该系统由crispr体系转录出的rna和cas体系翻译出的蛋白相结合来发挥切割dna的作用。目前在基因组编辑领域应用最为广泛的crispr/cas系统是ii型的spcas9系统，它使用crrnas与tracrrnas嵌合形成的引导rna与核酸酶cas9组成复合体来识别、切割dna，在基因组的特定位点造成dna双链断裂。相较于zfns和talens，crispr/cas9系统以其极度简单、低构建成本等优势，迅速成为了基因组编辑的主流技术，并普及发展成为了现代生命科学实验室必不可少的研究工具之一。cd55(cluster of differentiation 55)又称衰变加速因子(decay-accelerating factor,daf)，是由cd55基因编码而成的补体调节蛋白。人cd55蛋白分子量为70kda，能够通过抑制攻膜复合体(membrane attack complex，mac)的形成使细胞免受补体系统的攻击。由于成熟的红细胞没有细胞核，目前的研究报道中尚未实现在猪红细胞表面表达人补体调节蛋白cd55。
6、敲除猪的主要异种抗原能够降低人血清中90％以上的抗体结合，但仍会面临补体和免疫细胞介导的排斥作用。构建出能够在红细胞表面表达人补体调节蛋白的转基因猪对异种输血具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术的一个目的在于提供一种用于构建基因工程动物的sgrna，本专利技术的另一个目的在于提供一种构建用于异种输血的基因工程动物的方法，以及构建得到的基因工程动物及其应用。
2、本专利技术提供了一种sgrna，它的核苷酸序列如seq id no:1、seq id no:2、seq idno:3、seq id no:4或seq id no:5所示。
3、进一步地，所述sgrna的核苷酸序列如seq id no:3所示。
4、本专利技术还提供了另一种sgrna，它的核苷酸序列如它的核苷酸序列如seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9或seq id no:10所示。
5、进一步地，所述sgrna的核苷酸序列如seq id no:8所示。
6、本专利技术还提供了一种构建基因工程动物的方法，所述方法包括以下步骤：
7、(1)将seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seqid no:7、seq id no:8、seq id no:9或seq id no:10所述的sgrna与载体连接，构建敲除载体；
8、(2)构建表达人源保护蛋白的靶标dna序列；
9、(3)将敲除载体和含表达人源保护蛋白的靶标dna序列的载体共转染动物成纤维细胞，测序鉴定获得人源保护蛋白定点整合的阳性克隆细胞；
10、(4)将阳性克隆细胞作为核供体，动物卵母细胞去核后作为受体，进行体细胞核移植，得重构胚；
11、(5)取重构胚移入雌性动物体内，饲养雌性动物至产仔，取仔即得。
12、进一步地，步骤(1)中，所述载体为px458载体。
13、进一步地，步骤(3)中，所述含表达人源保护蛋白的靶标dna序列的载体为含表达人源保护蛋白的靶标dna序列的puc57克隆载体。
14、本专利技术中，人源保护性蛋白指能够增强异源细胞在宿主体内的生物兼容性，提高异源细胞的存活能力的蛋白。
15、进一步地，步骤(2)中，所述人源保护蛋白包括人补体调节蛋白、人抗细胞性排斥蛋白中的一种或两种；优选地，所述人抗细胞性排斥蛋白为人抗巨噬细胞吞噬蛋白或人抗t细胞激活蛋白；更优选地，所述人补体调节蛋白为cd55、cd46或cd59，所述人抗巨噬细胞吞噬蛋白为cd47，所述人抗t细胞激活蛋白为ctla4。
16、进一步地，步骤(2)中，所述表达人源保护蛋白的靶标dna序列包括依次连接的左同源臂、ef1α启动子、人源保护蛋白基因的cds序列、polya序列、右同源臂、hsv-tk序列；优选地，所述表达人源保护蛋白的靶标dna序列如seq id no:6或seq id no:11所示。
17、进一步地，步骤(3)中，所述成纤维细胞为异种抗原敲除的成纤维细胞，优选为α-gal、sda和neu5gc三种抗原敲除的成纤维细胞。
18、进一步地，所述动物为猪。
19、进一步地，所述方法本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种sgRNA，其特征在于，它的核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示。
2.根据权利要求1所述的sgRNA，其特征在于，它的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
3.一种sgRNA，其特征在于，它的核苷酸序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示。
4.根据权利要求1所述的sgRNA，其特征在于，它的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
5.一种构建基因工程动物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述载体为pX458载体。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述人源保护蛋白包括人补体调节蛋白、人抗细胞性排斥蛋白中的一种或两种；优选地，所述人抗细胞性排斥蛋白为人抗巨噬细胞吞噬蛋白或人抗T细胞激活蛋白；更优选地，所述人补体调节蛋白为CD55、CD46或CD5
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述表达人源保护蛋白的靶标DNA序列包括依次连接的左同源臂、EF1α启动子、人源保护蛋白基因的CDS序列、polyA序列、右同源臂、HSV-TK序列；优选地，所述表达人源保护蛋白的靶标DNA序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:11所示。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述成纤维细胞为异种抗原敲除的成纤维细胞，优选为α-gal、Sda和Neu5Gc三种抗原敲除的成纤维细胞。
10.根据权利要求5-9任一项所述的方法，其特征在于，所述动物为猪。
11.根据权利要求5-10任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
12.权利要求5-11任一项所述方法构建得到的基因工程动物。
13.权利要求12所述基因工程动物在异种输血中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种sgrna，其特征在于，它的核苷酸序列如seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4或seq id no:5所示。
2.根据权利要求1所述的sgrna，其特征在于，它的核苷酸序列如seq id no:3所示。
3.一种sgrna，其特征在于，它的核苷酸序列如seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9或seq id no:10所示。
4.根据权利要求1所述的sgrna，其特征在于，它的核苷酸序列如seq id no:8所示。
5.一种构建基因工程动物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述载体为px458载体。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述人源保护蛋白包括人补体调节蛋白、人抗细胞性排斥蛋白中的一种或两种；优选地，所述人抗细胞性排斥蛋白为人抗巨噬细胞吞噬蛋白或人抗t细胞激活蛋白；更优...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜嘉祥，王永，
申请(专利权)人：成都中科奥格生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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