【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，尤其涉及细胞分离，具体涉及一种分离提取高纯度活率外周血单核球的实用性方法。
技术介绍
1、外周血单核球又称外周血单核细胞(pbmc)是免疫细胞，包括淋巴细胞和单核细胞，其中淋巴细胞又包括t淋巴细胞，b淋巴细胞和nk细胞。其中t淋巴细胞是比例最多的淋巴细胞类型，在胸腺中发育成熟，主要功能就是执行人体的细胞免疫功能，在人体的免疫监视中发挥着重要的作用。b淋巴细胞属于人体的执行体液免疫功能的细胞，b淋巴细胞受抗原刺激以后，能够发育成熟为浆细胞，可以分泌各种抗体，发挥体液免疫功能nk细胞是人体非特异性免疫细胞，也在免疫监视中发挥着重要作用。单核细胞属于白细胞的一种，从血液中逸出到组织中就变成了吞噬细胞，也称为巨噬细胞，在人体的非特异性免疫功能中发挥着重要的作用。除了作为免疫系统的重要组成部分外，pbmc在疾病的治疗和诊断以及研究对药物或抗原的免疫反应。免疫调节细胞因具有维持机体的中枢和外周免疫耐受的特性，大量证据表明免疫调节细胞在预防自身免疫反应，减轻诸如感染、肿瘤、器官移植等因素造成的炎症反应和维持免疫稳态等方面均具有重要的作用，从外周血提取pbmc的过程中，能够得到越高活率以及细胞浓度比例的细胞数量就显得非常重要。然而现有技术中相关pbmc提取分离的方法获得的细胞纯度与活率不稳定，在一定程度上不利于其应用。
技术实现思路
1、本专利技术目的在提供一种简单且易于操作的标准制备流程，能够达到提取出高细胞数量与活性度的pbmc的一种体外提取方式。
2、本专利技
3、一种分离提取高纯度活率外周血单核球的实用性方法，包括如下步骤：
4、s1.外周血采集；
5、s2.预处理；
6、s3.分离提纯。
7、在一些具体实施方案中，所述s1中采集外周血10～120ml，取10-25ml加入50ml离心管中。
8、在一些具体实施方案中，选用15ml离心管。
9、在一些具体实施方案中，所述s2包括离心后收集血浆、灭活、离心后收集上清、冷冻保存。
10、进一步的，s2中离心后收集血浆的操作为4℃下，1800rpm离心10分钟(贝克曼台式高速低温冷冻离心机)，离心出血浆；吸取上层血浆，装入离心管中。
11、进一步的，s2中灭活的操作为将上述离心管密封，于56℃下灭活30分钟。
12、一个优选的方式，灭活的操作为将上述离心管用封口膜封好，于56℃下灭活30分钟。
13、进一步的，s2中离心后收集上清的操作为将上述灭活后的血浆在4℃下，1800rpm离心10分钟；收集上清。
14、进一步的，s2中冷冻保存的操作为将上述收集的上清，放入4℃冰箱冷藏15分钟，再转入-20℃冰箱冻存。细胞扩增时，自体血浆可做为使用。
15、在一些具体实施方案中，所述s3包括加缓冲液、加分离液、离心后收集pbmc层、清洗。
16、进一步的，s3中加缓冲液的操作为将上述血液与缓冲液以体积比无菌注射用生理盐水：外周血＝1:1的方式混匀。
17、一个优选的方式，s3中加缓冲液的操作为将上述血液与缓冲液以体积比1：1的方式混匀，所述缓冲液为生理盐水，血液为6ml，生理盐水为6ml。
18、进一步的，s3中加分离液的操作为在离心管中加入分离液，再加入上述稀释后的血液，分离液与稀释后的血液的体积比为1.5～2：1。
19、一个优选的方式，s3中加分离液的操作为在50ml离心管中加入淋巴细胞分离液，再加入上述稀释后的血液，淋巴细胞分离液与稀释后的血液的体积比为2：1。
20、进一步的，s3中离心后收集pbmc层的操作为在4℃下，1400rpm离心30分钟；离心后液体从上到下分层，分别为血浆层、pbmc层、分离液层、红细胞层；先去掉血浆层，再收集pbmc层加入新的离心管中。
21、一个优选的方式，s3中离心后收集pbmc层的操作为在4℃下，1400rpm离心30分钟，设置为rotor 8，升4降4，离心机：贝克曼j-15r；离心后液体从上到下分层，分别为血浆层、pbmc层、分离液层、红细胞层；先用吸管吸掉血浆层，再用吸管吸取pbmc层加入新的15ml离心管中(此处使用的为贝克曼台式高速低温冷冻离心机，如更动设备型号或是离心机转子类型，转速在1400-1600rpm，升4降5)。
22、进一步的，s3中清洗的操作为s3中清洗的操作为加入生理盐水直到15ml，在4℃下，1400rpm离心10分钟，设置为rotor 8，升4降4，离心机：贝克曼j-15r；弃上清，加入2ml细胞培养液，均匀吹打细胞团块；在4℃下，1400rpm离心10分钟，设置为rotor 8，升4降4，离心机：贝克曼j-15r；弃上清，加入0.5ml细胞培养液，均匀吹打细胞团块。
23、在一些具体实施方案中，s3中清洗的操作为先将pbmc收集入50ml离心管，再加入生理盐水缓冲液直到45ml，在4℃下，1400rpm离心10分钟，弃上清，而后加入1～2ml细胞培养液，均匀吹打细胞团块，细胞团块均匀散开后，再加入3ml细胞培养液到5ml；最后在4℃下，1400rpm离心10分钟，弃上清，加入1ml细胞培养液，均匀吹打细胞团块。
24、一种分离提取高纯度活率外周血单核球的实用性方法，采集外周血10～120ml，取10～25ml加入50ml离心管中；4℃下，1800rpm离心10分钟，离心出血浆；用吸管吸取上层血浆，装入15ml离心管中，用封口膜封好，于56℃下灭活30分钟；4℃下，1800rpm离心10分钟；收集上清；放入4℃冰箱冷藏15分钟，再转入-20℃冰箱冻存；将上述血液与缓冲液以体积比1：1的方式混匀(如：所述缓冲液为注射用无菌生理盐水，若血液为6ml，生理盐水则为6ml，以1:1方式稀释)；在50ml离心管中加入淋巴细胞分离液，再加入上述稀释后的血液，淋巴细胞分离液与稀释后的血液的体积比为1.5～2：1；在4℃下，1400rpm离心30分钟；离心后液体从上到下分层，分别为血浆层、pbmc层、分离液层、红细胞层；先用10ml移液管吸掉上层血清层，再用吸管吸取pbmc层并打入新的50ml离心管中，收集完成后；加入生理盐水直到45ml，在4℃下，1400rpm离心10分钟；弃上清，加入5ml细胞培养液，均匀吹打细胞团块；在4℃下，1400rpm离心10分钟；弃上清，加入1ml细胞培养液，均匀吹打细胞团块。
25、对分离提取到的细胞进行检测，检测方法为，取20ul细胞悬液，用细胞计数仪计数，流式细胞实验检测细胞活率。
26、与现有技术相比，本专利技术具备如下有益效果：
27、提供一种简单且易于操作的标准制备流程，方法优化后的结果能够达到提取出高细胞数量与活性度的pbmc。不仅可以高效率提取出pbmc细胞数量，还可以精算出需要使用的试剂与耗材；每一冻存管可存放的细胞数量均等；依照标准流程提供提取本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种分离提取高纯度活率外周血单核球的实用性方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1中采集外周血10～120mL，取10～25mL加入50mL离心管中。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S2包括离心后收集血浆、灭活、离心后收集上清、冷冻保存。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述S2中离心后收集血浆的操作为4℃下，1800rpm离心10分钟，离心出血浆；吸取上层血浆，装入离心管中；所述S2中灭活的操作为将上述离心管密封，于56℃下灭活30分钟；所述S2中离心后收集上清的操作为将上述灭活后的血浆在4℃下，1800rpm离心10分钟，收集上清；所述S2中冷冻保存的操作为将上述收集的上清，在4℃下冷藏15分钟，再转入-20℃下冻存。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S3包括加缓冲液、加分离液、离心后收集PBMC层、清洗。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述S3中加缓冲液的操作为将上述血液与缓冲液以体积比无菌注射用生理盐水：外周血＝1
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述S3中加分离液的操作为在离心管中加入分离液，再加入上述稀释后的血液，分离液与稀释后的血液的体积比为1.5～2：1。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述S3中离心后收集PBMC层的操作为在4℃下，1400rpm离心30分钟；离心后液体从上到下分层，分别为血浆层、PBMC层、分离液层、红细胞层；先去掉血浆层，再收集PBMC层加入新的离心管中。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述S3中清洗的操作为先将PBMC收集入50mL离心管，再加入生理盐水缓冲液直到45mL，在4℃下，1400rpm离心10分钟，弃上清，而后加入1-2mL细胞培养液，均匀吹打细胞团块，细胞团块均匀散开后，再加入3mL细胞培养液到5mL；最后在4℃下，1400rpm离心10分钟，弃上清，加入1mL细胞培养液，均匀吹打细胞团块。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采集外周血10～120mL，取10～25mL加入50mL离心管中；4℃下，1800rpm离心10分钟，离心出血浆；用吸管吸取上层血浆，装入15mL离心管中，用封口膜封好，于56℃下灭活30分钟；4℃下，1800rpm离心10分钟；收集上清；放入4℃冰箱冷藏15分钟，再转入-20℃冰箱冻存；将上述血液与缓冲液以体积比1：1的方式混匀；在50mL离心管中加入淋巴细胞分离液，再加入上述稀释后的血液，淋巴细胞分离液与稀释后的血液的体积比为1.5～2：1；在4℃下，1400rpm离心30分钟；离心后液体从上到下分层，分别为血浆层、PBMC层、分离液层、红细胞层；先用10mL移液管吸掉上层血清层，再用吸管吸取PBMC层并打入新的50mL离心管中，收集完成后；加入生理盐水直到45mL，在4℃下，1400rpm离心10分钟；弃上清，加入5mL细胞培养液，均匀吹打细胞团块；在4℃下，1400rpm离心10分钟；弃上清，加入1mL细胞培养液，均匀吹打细胞团块。
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1.一种分离提取高纯度活率外周血单核球的实用性方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述s1中采集外周血10～120ml，取10～25ml加入50ml离心管中。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述s2包括离心后收集血浆、灭活、离心后收集上清、冷冻保存。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述s2中离心后收集血浆的操作为4℃下，1800rpm离心10分钟，离心出血浆；吸取上层血浆，装入离心管中；所述s2中灭活的操作为将上述离心管密封，于56℃下灭活30分钟；所述s2中离心后收集上清的操作为将上述灭活后的血浆在4℃下，1800rpm离心10分钟，收集上清；所述s2中冷冻保存的操作为将上述收集的上清，在4℃下冷藏15分钟，再转入-20℃下冻存。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述s3包括加缓冲液、加分离液、离心后收集pbmc层、清洗。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述s3中加缓冲液的操作为将上述血液与缓冲液以体积比无菌注射用生理盐水：外周血＝1:1的方式混匀。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述s3中加分离液的操作为在离心管中加入分离液，再加入上述稀释后的血液，分离液与稀释后的血液的体积比为1.5～2：1。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述s3中离心后收集pbmc层的操作为在4℃下，1400rpm离心30分钟；离心后液体从上到下分层，分别为血浆层、pbmc层...
【专利技术属性】
技术研发人员：郜恒骏，贺巾帼，张小燕，曾杭，刘晶晶，
申请(专利权)人：上海芯超生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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