【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物催化领域，涉及一种来源于诺卡氏菌属的亚胺还原酶突变体及其应用。
技术介绍
1、手性化合物是指具有手性碳原子的有机化合物，手性药物中两种对映体可能具有完全不同的药效作用，产生严重的副作用，如20世纪发生的“反应停”事件中使用的抗妊娠反应药物沙利度胺展示了立体异构体的不同效应。手性胺化合物，特别是环状手性胺药物，是重要的医药中间体，其不对称合成技术一直备受关注，同时也是生物催化的重要研究内容之一。
2、随着酶催化技术的发展，转氨酶、亚胺还原酶、还原胺化酶、胺脱氢酶等多种酶类被发现，并可以应用于手性胺的合成过程。然而，不同的酶具有不同的特点。例如，某些酶的活性比较低、底物谱较窄，需要复杂的辅酶再生系统的参与。为此，寻找高活性和高立体选择性的生物酶催化剂用于制备手性胺尤为重要。
3、(s)-去甲烟碱，又名(s)-降烟碱，英文名(s)-(-)-nornicotine，cas号：494-97-3，分子式c9h12n2，结构式如下，是一种尼古丁代谢物和烟草生物碱，可以在电子烟中被用作烟草戒断剂。
4、
5、化学法合成该化合物多采用麦斯明为原料，使用手性衍生剂或金属催化剂经过多步反应制得，产品光学纯度和收率不高，并容易造成环境污染，在实际大规模生产中有诸多限制。亚胺还原酶是一类能够催化亚胺还原的生物催化剂，近年来，使用生物酶法催化合成(s)-去甲烟碱备受关注，虽然已经有许多关于亚胺还原酶催化还原麦斯明并在工业化上应用生产的报道，但在目前酶催化的工业化应用中，还存在酶特异性不强，酶
6、us10913962.b2报道了亚胺还原酶催化麦斯明还原生成(s)-去甲烟碱的例子，底物浓度可达到0.4mol/l(58.4g/l)，提高底物浓度，转化率明显下降。后来，陆续有研究人员利用亚胺还原酶突变体催化麦斯明生成(s)-去甲烟碱，以提高反应体系的底物浓度，提高酶催化的转化效率。cn 113774036a利用来源于nocardiopsis aiba菌株的亚胺还原酶突变体(a246v和d285v)在100g/l底物浓度、0.3wt菌体湿重、204g/l葡萄糖浓度和150ml/l葡萄糖脱氢酶的反应体系中反应4小时，转化率可达99.9％，e.e.％可达99.0％，表现出了很好的对映体选择性和活性，但该酶稳定性较差，在催化麦斯明制备(s)-去甲烟碱的反应中对ph值要求较高，催化反应ph在8.5情况下，24h反应转化率仅为35.5％，且其辅酶再生系统的用量较高，导致生产成本较高。
7、因此，工业上有必要寻找不同高活性的亚胺还原酶，以适应更宽的ph环境，同时降低辅酶再生系统的用量，来降低生产成本。
技术实现思路
1、为了在温和的反应条件下高效合成(s)-去甲烟碱，本专利技术对来源于诺卡氏菌属(nocardiopsis aiba)的亚胺还原酶naired进行定向进化，获得酶活力及底物耐受提高的亚胺还原酶突变体，降低辅酶再生系统(葡萄糖脱氢酶/葡萄糖)的用量，对麦斯明(cas:532-12-7)进行还原从而制备高手性纯度的(s)-去甲烟碱，转化率达到99.9％以上，产物光学纯度＞99.5％，在ph 6.0-9.0范围内都能维持85％以上的催化还原活性，同时降低了生产成本，提供一种适合工业化生产的制备工艺。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、一方面提供的亚胺还原酶突变蛋白，所述的突变蛋白为非天然蛋白，且所述突变蛋白是在对应于seq id中的位点71，126，127，174、178和181在内的一个或多个位点突变的亚胺还原酶突变体：
4、优选地，所述的第71位点的半胱氨酸突变为天冬酰胺。
5、优选地，所述的第126位点的丙氨酸突变为天冬酰胺。
6、优选地，所述的第127位点的苏氨酸突变为脯氨酸。
7、优选地，所述的第174位点的天冬氨酸突变为谷氨酸。
8、优选地，所述的第178位点的亮氨酸突变为半胱氨酸。
9、更优选的是下述组合突变：第126位点的丙氨酸突变为天冬酰胺且第181位甲硫氨酸突变为亮氨酸。一种亚胺还原酶突变体，所述亚胺还原酶突变体的氨基酸序列是seq idno:1发生组合突变的氨基酸序列，突变点位为：第126位点的丙氨酸突变为天冬酰胺且第181位甲硫氨酸突变为亮氨酸，其氨基酸序列如seq id no:7所示。
10、所述亚胺还原酶突变体的编码基因，其核苷酸序列如seq id no:14所示。
11、本专利技术基于nocardiopsis aiba菌株的天然亚胺还原酶而改进的亚胺还原酶及其编码基因，利用亚胺还原酶突变体作为生物酶催化剂催化底物麦斯明合成(s)-去甲烟碱，反应式如下：
12、
13、式中：nad是生物学专有名词，中文名：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，简称为辅酶；(p)表示括号内p可有可无，当有时，为nadp。nadp的中文名是烟酰胺腺嗓呤二核苷酸磷酸，又称为三磷酸吡啶核苷酸(tpn)或辅脱氢酶π或氧化型辅酶π。
14、一种重组质粒，含有所述亚胺还原酶突变体的编码基因。优选地，所述质粒为pet-28a(+)。
15、—种宿主细胞，含有所述的重组质粒。优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)细胞。
16、上述亚胺还原酶及其突变体的制备方法，包括以下步骤：
17、活化菌株：将负载有seq id no.1基因的基因工程菌接种至lb抗性培养基中，控制摇床温度35-38℃，转速200-220rpm，培养10-12h，获得种子液；制备粗酶液；将所述种子液接种至lb抗性培养基中，控制摇床温度35-38℃，转速200-220rpm，培养菌液2.5-3.5h，当od600值为0.6-0.8时添加诱导剂，控制摇床温度16-25℃，转速180-200rpm，继续诱导培养18-20h，然后离心分离，收集沉淀，超声破碎，获得所述的亚胺还原酶粗酶液。
18、进一步的，所述基因工程菌的构建方法包括以下步骤：
19、以seq id no.1的基因为目的基因，以质粒pet28a(+)为表达载体，将所述目的基因插入所述表达载体中获得重组质粒，将所述重组质粒导入宿主菌株中，得到所述基因工程菌。
20、所述的亚胺还原酶突变体在制备手性(s)-去甲烟碱中的应用。
21、上面所述的亚胺还原酶突变体催化如下反应：具体地，所述催化反应以含亚胺还原酶突变体编码基因工程菌经培养后的菌体全细胞或破碎液上清作为催化剂，以麦斯明为底物，以nad(p+)为辅酶，葡萄糖脱氢酶/葡萄糖为再生系统，在25-35℃、ph6.0-9.0、150-250rpm搅拌条件下反应12±4h，催化反应合成(s)-去甲烟碱。
22、优选地，nad(p+)的浓度为0.1-1.0g/l。
23本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种亚胺还原酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2-7所示任意一种。
2.权利要求1所示亚胺还原酶突变体的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO:9-14所示任意一种。
3.一种重组质粒，其特征在于，含有权利要求2所述亚胺还原酶突变体的编码基因。
4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述质粒为pET-28a(+)。
5.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求3或4所述的重组质粒。
6.根据权利要求5所述宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)细胞。
7.权利要求1所述的亚胺还原酶突变体在制备手性(S)-去甲烟碱中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，以麦斯明为底物，以NAD(P+)为辅酶，葡萄糖脱氢酶/葡萄糖为再生系统，在25-35℃、pH6.0-9.0、150-250rpm搅拌条件下反应12±4h，催化反应合成(S)-去甲烟碱。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述催化反应中，催化底物浓度为
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，NAD(P+)的浓度为0.1-1.0g/L，葡萄糖浓度为30-100g/L，葡萄糖脱氢酶粗酶液为50-500mL/L。
...【技术特征摘要】
1.一种亚胺还原酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no:2-7所示任意一种。
2.权利要求1所示亚胺还原酶突变体的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq idno:9-14所示任意一种。
3.一种重组质粒，其特征在于，含有权利要求2所述亚胺还原酶突变体的编码基因。
4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述质粒为pet-28a(+)。
5.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求3或4所述的重组质粒。
6.根据权利要求5所述宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)细胞。
7.权利要求1所述的亚胺还原酶突变体在制...
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