【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物基因工程领域，特别是一种抑制nlduox表达的干扰菌株及其制备方法。
技术介绍
1、褐飞虱是我国水稻上的主要刺吸式口器害虫，具有远距离迁飞习性，环境适应能力强，且能传播水稻病毒，在外界条件适宜时极易暴发成灾，给水稻生产造成严重损失。长期以来，化学防治一直是控制褐飞虱的重要手段，但化学杀虫剂的持续大量使用，不仅增加生产成本，而且杀伤天敌、增加褐飞虱抗药性，引起褐飞虱的再猖獗和农药残留污染。
2、生物防治是替代化学农药使用、实现绿色植保的有效途径。生防微生物具有广谱高毒力、对环境友好以及不易使害虫产生抗药性等诸多优点，在害虫的生物防治中占据重要的地位。其中，生防真菌主要通过独特的体壁接触侵染模式而致死各类害虫，对刺吸式口器害虫的防治具有明显的优势，已被开发成多种商品制剂用于蚜虫、粉虱等刺吸式害虫的防治。目前国内外已有诸多学者通过真菌分离培养和生物测定方法筛选到了对褐飞虱具有毒力的生防真菌菌株。然而，与化学农药相比，生防真菌杀虫速度较为缓慢，其田间防效受到害虫自身免疫防御保护系统的制约。削弱褐飞虱免疫防御反应是提升生防真菌对褐飞虱杀虫效率的关键。
3、rnai技术可高效特异的抑制靶标基因的转录表达，在害虫防控研究领域具有极大的应用价值。通过人工合成dsrna靶向沉默影响害虫生长发育或重要行为的关键基因，可以有效降低虫口数量，达到害虫防控的效果。该技术主要依赖于合适的靶基因和稳定的dsrna递送系统。注射，饲喂和载体介导是目前主要的三种dsrna递送方式，其中，注射方式主要用于实验室场景，不适合
4、双氧化酶(dual oxidase，duox)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶家族成员之一，属于跨膜蛋白，一般含有铁还原酶结构域、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结构域、n-端钙离子结合域、黄素腺嘌呤二核苷酸结构域和过氧化物酶结构域。duox主要通过介导细胞活性氧自由基(reactive oxygen species，ros)的产生，在昆虫生长发育、维持肠道菌群稳态以及抵御外源病原物入侵等生理过程中发挥重要调控作用，是进行害虫防治的潜在基因靶标。
5、本专利技术创造性的想到结合生防真菌和rnai两种害虫防治策略，通过基因工程手段实现提高生防真菌对褐飞虱的杀虫效率。
技术实现思路
1、为解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种抑制nlduox表达的干扰菌株及其制备方法，本专利技术通过基因工程手段构建生防真菌重组菌株，该菌株表达dsrna以敲低褐飞虱免疫防御相关基因—双氧化酶nlduox基因，从而提高生防真菌对褐飞虱的杀虫效率。
2、为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：
3、一种抑制nlduox表达的干扰菌株，干扰靶标基因nlduox在褐飞虱体内表达的菌株为具有nlduox dsrna的金龟子绿僵菌；
4、nlduox dsrna正向序列：
5、gaggcatggataacagcgatgaggtccttcgagaacggaacccttctaagtgatgcctcagggaagttacctgttaagaatactatgagggtgccactattcaacaatcctgtaccaaatgtactcaggactctgagtcctgaacgattatttttacttggtgatccgaggagcaaccagaacccggctcttctctcgttcggcatccttttctttcgctggcacaacaaggtggctgaaagagtgcagaaggaacaccccgactggcctgatgaagaggtcttccagagggctaggaggattgttgtcgctacactacagaacataataatgtatgaatacctgccagcttttctgggtcaggagctgcctccgtacagcggctacaacgtggacacgcatccaggcatcagtcacgtgtttcagtcggctgcattccgctttggccacaccatgataccacctggcatctaccgcagggatgccaactgtcagttcaggaagacatccatgggcaaccctgctctcaggctgtgttctcattggtgggatagcagtgacgtaatggtagacaccaccctggagga seq id no：07；
6、nlduox dsrna反向序列：
7、tcctccagggtggtgtctaccattacgtcactgctatcccaccaatgagaacacagcctgagagcagggttgcccatggatgtcttcctgaactgacagttggcatccctgcggtagatgccaggtggtatcatggtgtggccaaagcggaatgcagccgactgaaacacgtgactgatgcctggatgcgtgtccacgttgtagccgctgtacggaggcagctcctgacccagaaaagctggcaggtattcatacattattatgttctgtagtgtagcgacaacaatcctcctagccctctggaagacctcttcatcaggccagtcggggtgttccttctgcactctttcagccaccttgttgtgccagcgaaagaaaaggatgccgaacgagagaagagccgggttctggttgctcctcggatcaccaagtaaaaataatcgttcaggactcagagtcctgagtacatttggtacaggattgttgaatagtggcaccctcatagtattcttaacaggtaacttccctgaggcatcacttagaagggttccgttctcgaaggacctcatcgctgttatccatgcctc seq id no：08。
8、前述的一种抑制nlduox表达的干扰菌株，干扰菌株为mat3干扰菌株，mat3干扰菌株为基因bar和nlduox dsrna正、反向片段能在t3转化子中检测出的菌株。
9、前述的一种抑制nlduox表达的干扰菌株，干扰菌株为mat4干扰菌株，mat4干扰菌株为基因bar和nlduox dsrna正、反向片段能在t4转化子中检测出的菌株。
10、一种抑制nlduox表达的干扰菌株的制备方法，提取褐飞虱rna合成褐飞虱cdna，克隆nlduox基因并测本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抑制NlDuox表达的干扰菌株，其特征在于，干扰靶标基因NlDuox在褐飞虱体内表达的菌株为具有NlDuox dsRNA的金龟子绿僵菌；
2.根据权利要求1所述的一种抑制NlDuox表达的干扰菌株，其特征在于，所述干扰菌株为MaT3干扰菌株，所述MaT3干扰菌株为基因bar和NlDuox dsRNA正、反向片段能在T3转化子中检测出的菌株。
3.根据权利要求1所述的一种抑制NlDuox表达的干扰菌株，其特征在于，所述干扰菌株为MaT4干扰菌株，所述MaT4干扰菌株为基因bar和NlDuox dsRNA正、反向片段能在T4转化子中检测出的菌株。
4.一种抑制NlDuox表达的干扰菌株的制备方法，其特征在于，提取褐飞虱RNA，合成褐飞虱cDNA，克隆NlDuox基因并测序，分析NlDuox基因的金龟子绿僵菌诱导表达模式，再通过构建NlDuox-RNAi干扰载体并转化金龟子绿僵菌得到NlDuox干扰转化子，筛选得到可干扰靶标基因NlDuox在褐飞虱体内表达的菌株。
5.根据权利要求4所述的一种抑制NlDuox表达的干扰菌株的制备方
6.根据权利要求4所述的一种抑制NlDuox表达的干扰菌株的制备方法，其特征在于，所述构建NlDuox-RNAi干扰载体的方法具体步骤如下：
7.根据权利要求6所述的一种抑制NlDuox表达的干扰菌株的制备方法，其特征在于，所述步骤一中：
8.根据权利要求6所述的一种抑制NlDuox表达的干扰菌株的制备方法，其特征在于，所述步骤二中：
9.根据权利要求4所述的一种抑制NlDuox表达的干扰菌株的制备方法，其特征在于，所述转化得到NlDuox干扰转化子的方法为采用所述NlDuox-RNAi干扰载体质粒pNlDuoxds通过农杆菌介导的转化方法导入金龟子绿僵菌Ma456菌株中，得到NlDuox干扰转化子。
...【技术特征摘要】
1.一种抑制nlduox表达的干扰菌株，其特征在于，干扰靶标基因nlduox在褐飞虱体内表达的菌株为具有nlduox dsrna的金龟子绿僵菌；
2.根据权利要求1所述的一种抑制nlduox表达的干扰菌株，其特征在于，所述干扰菌株为mat3干扰菌株，所述mat3干扰菌株为基因bar和nlduox dsrna正、反向片段能在t3转化子中检测出的菌株。
3.根据权利要求1所述的一种抑制nlduox表达的干扰菌株，其特征在于，所述干扰菌株为mat4干扰菌株，所述mat4干扰菌株为基因bar和nlduox dsrna正、反向片段能在t4转化子中检测出的菌株。
4.一种抑制nlduox表达的干扰菌株的制备方法，其特征在于，提取褐飞虱rna，合成褐飞虱cdna，克隆nlduox基因并测序，分析nlduox基因的金龟子绿僵菌诱导表达模式，再通过构建nlduox-rnai干扰载体并转化金龟子绿僵菌得到nlduox干扰转化...
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