【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术的领域涉及使用多种载体递送大型治疗性蛋白质或诱导其产生的方法。
技术介绍
1、使用aav载体的基因疗法在治疗不同的功能丧失性遗传性病症方面具有广阔的前景(li 2020)。然而，这种治疗方式因该病毒载体的小包装容量(～5kb)而受到挑战。
技术实现思路
1、本文所述的方法和组合物部分基于以下发现：分裂内含肽可以允许使用aav载体递送大型多肽，包括但不限于肌营养不良蛋白。
2、在一个方面，本文描述的是一种用于将外源多肽递送至细胞的方法，所述方法包括使细胞接触：第一腺相关病毒(aav)载体颗粒，其包含编码第一融合多肽的第一核酸，所述第一融合多肽包含与分裂内含肽的第一部分融合的外源多肽的第一部分；以及第二aav载体颗粒，其包含编码第二融合多肽的第二核酸，所述第二融合多肽包含与分裂内含肽的第二部分融合的外源多肽的第二部分；其中第一融合多肽和第二融合多肽在细胞中由第一核酸和第二核酸产生，并且其中分裂内含肽的第一部分和第二部分促进外源多肽的第一部分与外源多肽的第二部分的连接，从而将外源多肽递送至细胞；其中所递送的外源多肽大于单个aav载体颗粒可以编码的多肽。
3、在本文描述的这个方面和所有其他方面的一个实施方案中，第一核酸和第二核酸包含肌肉特异性表达盒(msec)。
4、在本文描述的这个方面和所有其他方面的另一个实施方案中，分裂内含肽是天然存在的分裂内含肽。
5、在本文描述的这个方面和所有其他方面的另一个实施方案中，分裂内含肽是基因修饰
6、在本文描述的这个方面和所有其他方面的另一个实施方案中，外源多肽的第一部分和第二部分的大小基本上相同。
7、在本文描述的这个方面和所有其他方面的另一个实施方案中，外源多肽的第一部分和第二部分的大小相差不超过50个氨基酸。
8、在本文描述的这个方面和所有其他方面的另一个实施方案中，外源多肽包含来自分裂内含肽的少于四个氨基酸的足迹。
9、在本文描述的这个方面和所有其他方面的另一个实施方案中，外源多肽包含来自分裂内含肽的3个或更少氨基酸的足迹。
10、在本文描述的这个方面和所有其他方面的另一个实施方案中，将外源多肽的第一部分和第二部分分开的分裂位点选择在具有与分裂内含肽足迹相同的序列的位点处，从而产生不含来自分裂内含肽的额外氨基酸的外源多肽。
11、在本文描述的这个方面和所有其他方面的另一个实施方案中，外源多肽是治疗性多肽。
12、在本文描述的这个方面和所有其他方面的另一个实施方案中，治疗性多肽选自肌营养不良蛋白、微型肌营养不良蛋白、utrophin和dysferlin、伴肌动蛋白、肌联蛋白、肌球蛋白、含血影蛋白重复的核包膜蛋白1(syne-1)、肌营养不良蛋白聚糖(dystroglycan)、atp合酶、凝血因子iix、核纤层蛋白a/c、甲状腺球蛋白、表皮生长因子受体(egfr)、α和/或β血影蛋白、雷帕霉素的肌肉靶标(mtor)以及利阿诺定(ryanodine)受体1。在另一个实施方案中，微型肌营养不良蛋白大于160kda并且小于全长肌营养不良蛋白。
13、在本文描述的这个方面和所有其他方面的另一个实施方案中，治疗性多肽是肌营养不良蛋白，并且肌营养不良蛋白外显肽的n端部分在肌营养不良蛋白铰链结构域内或附近与分裂内含肽的n端部分连接。
14、在本文描述的这个方面和所有其他方面的另一个实施方案中，铰链结构域包含肌营养不良蛋白的铰链1、2、3或4。
15、在本文描述的这个方面和所有其他方面的另一个实施方案中，治疗性多肽是肌营养不良蛋白，并且肌营养不良蛋白外显肽的n端部分在24个肌营养不良蛋白血影蛋白样重复结构域中的一个内与将螺旋b与螺旋c或螺旋c与螺旋a’连接的环结构域连接。
16、在本文描述的这个方面和所有其他方面的另一个实施方案中，治疗性多肽是肌营养不良蛋白，并且肌营养不良蛋白外显肽的c端部分在肌营养不良蛋白铰链结构域内或附近与分裂内含肽的c端部分连接或在24个肌营养不良蛋白血影蛋白样重复结构域中的一个内与将螺旋b与螺旋c或螺旋c与螺旋a’连接的环结构域连接。在本文描述的这个方面和所有其他方面的另一个实施方案中，铰链结构域包含肌营养不良蛋白的铰链1、2、3或4。
17、在本文描述的这个方面和所有其他方面的另一个实施方案中，外源多肽在细胞中具有功能。
18、在另一方面，本文描述的是一种用于将外源多肽递送至细胞的方法，所述方法包括使细胞接触：第一腺相关病毒(aav)载体颗粒，其包含编码第一融合多肽的第一核酸，所述第一融合多肽包含与第一分裂内含肽的第一部分融合的外源多肽的第一部分，其中分裂内含肽的第一部分与外源多肽的第一部分的羧基端融合；第二aav载体颗粒，其包含编码第二融合多肽的第二核酸，所述第二融合多肽包含外源多肽的第二部分，所述第二部分(i)在外源多肽的第二部分的氨基端与第一分裂内含肽的第二部分融合并且(ii)在外源多肽的第二部分的羧基端与第二分裂内含肽的第一部分融合；以及第三aav载体颗粒，其包含编码第三融合多肽的第三核酸，所述第三融合多肽包含外源多肽的第三部分，所述第三部分在外源多肽的第三部分的氨基端与第二分裂内含肽的第二部分融合，其中第一融合多肽、第二融合多肽和第三融合多肽在细胞中由第一核酸、第二核酸和第三核酸产生，并且其中第一分裂内含肽和第二分裂内含肽的相应部分促进(a)外源多肽的第一部分的羧基端与外源多肽的第二部分的氨基端的连接以及(b)外源多肽的第二部分的羧基端与外源多肽的第三部分的氨基端的连接，从而将外源多肽递送至细胞；其中所递送的外源多肽大于单个aav载体颗粒可以编码的多肽。在本文描述的这个方面和所有其他方面的一个实施方案中，第一分裂内含肽和第二分裂内含肽不交叉剪接。
19、在另一方面，本文描述的是一种包含一组aav载体颗粒的蛋白质表达系统，所述aav载体颗粒组包括第一aav颗粒和第二aav颗粒，其中第一aav载体颗粒包含编码第一融合多肽的第一核酸，所述第一融合多肽包含与分裂内含肽的第一部分融合的外源多肽的第一部分；并且其中第二aav载体颗粒包含编码第二融合多肽的第二核酸，所述第二融合多肽包含与分裂内含肽的第二部分融合的外源多肽的第二部分。
20、在本文描述的这个方面和所有其他方面的一个实施方案中，用第一aav载体颗粒和第二aav载体颗粒共感染细胞促进外源多肽的第一部分与外源多肽的第二部分的连接，同时去除分裂内含肽的第一部分和第二部分。
21、在本文描述的这个方面和所有其他方面的另一个实施方案中，外源多肽的第一部分与外源多肽的第二部分连接，同时去除分裂内含肽的第一部分和第二部分，产生比在单个aav颗粒中可以编码的多肽更大的外源多肽。<本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于将外源多肽递送至细胞的方法，所述方法包括使所述细胞接触：
2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一核酸和所述第二核酸包含肌肉特异性表达盒(MSEC)。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述分裂内含肽是天然存在的分裂内含肽。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述分裂内含肽是基因修饰的分裂内含肽。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述分裂内含肽的基因修饰选自针对在哺乳动物细胞中的表达和/或稳定性的密码子优化、所述分裂内含肽的缩短或延长，或改变所述分裂内含肽中的编码氨基酸以更紧密地匹配待递送的所述外源蛋白的序列。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述外源多肽的所述第一部分和所述第二部分的大小基本上相同。
7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述外源多肽的所述第一部分和所述第二部分的大小相差不超过50个氨基酸。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述外源多肽包含来自所述分裂内含肽的少于四个氨基酸的足迹。
9.如权利要求8所述的方
10.如权利要求9所述的方法，其中将所述外源多肽的所述第一部分和所述第二部分分开的分裂位点选择在具有与所述分裂内含肽足迹相同的序列的位点处，从而产生不含来自所述分裂内含肽的额外氨基酸的所述外源多肽。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述外源多肽是治疗性多肽。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述治疗性多肽选自肌营养不良蛋白、微型肌营养不良蛋白、utrophin和dysferlin、伴肌动蛋白、肌联蛋白、肌球蛋白、含血影蛋白重复的核包膜蛋白1(Syne-1)、肌营养不良蛋白聚糖、ATP合酶、凝血因子IIX、核纤层蛋白A/C、甲状腺球蛋白、表皮生长因子受体(EGFR)、α和/或β血影蛋白、雷帕霉素的肌肉靶标(mTOR)以及利阿诺定受体1。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述微型肌营养不良蛋白大于160kDa并且小于全长肌营养不良蛋白。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述治疗性多肽是肌营养不良蛋白，并且所述肌营养不良蛋白外显肽的N端部分在肌营养不良蛋白铰链结构域内或附近与分裂内含肽的N端部分连接。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述铰链结构域包含肌营养不良蛋白的铰链1、2、3或4。
16.如权利要求12所述的方法，其中所述治疗性多肽是肌营养不良蛋白，并且所述肌营养不良蛋白外显肽的N端部分在24个肌营养不良蛋白血影蛋白样重复结构域中的一个内与将螺旋b与螺旋c或螺旋c与螺旋a’连接的环结构域连接。
17.如权利要求12所述的方法，其中所述治疗性多肽是肌营养不良蛋白，并且所述肌营养不良蛋白外显肽的C端部分在肌营养不良蛋白铰链结构域内或附近与所述分裂内含肽的C端部分连接或在24个肌营养不良蛋白血影蛋白样重复结构域中的一个内与将螺旋b与螺旋c或螺旋c与螺旋a’连接的环结构域连接。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述铰链结构域包含肌营养不良蛋白的铰链1、2、3或4。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述外源多肽在所述细胞中具有功能。
20.一种用于将外源多肽递送至细胞的方法，所述方法包括使所述细胞接触：
21.如权利要求20所述的方法，其中所述第一分裂内含肽和所述第二分裂内含肽不交叉剪接。
22.一种蛋白质表达系统，其包含一组AAV载体颗粒，所述AAV载体颗粒组包括第一AAV颗粒和第二AAV颗粒，
23.如权利要求22所述的蛋白质表达系统，其中用所述第一AAV载体颗粒和所述第二AAV载体颗粒共感染细胞促进所述外源多肽的所述第一部分与所述外源多肽的所述第二部分的连接，同时去除所述分裂内含肽的所述第一部分和所述第二部分。
24.如权利要求22或23所述的蛋白质表达系统，其中所述外源多肽的所述第一部分与所述外源多肽的所述第二部分连接，同时去除所述分裂内含肽的所述第一部分和所述第二部分，产生比在单个AAV颗粒中能够编码的多肽更大的外源多肽。
25.一种蛋白质表达系统，其包含一组AAV载体颗粒，所述AAV载体颗粒组包括第一AAV颗粒、第二AAV颗粒和第三AAV颗粒，
26.如权利要求25所述的蛋白质表达系统，其中用所述第一AAV载体颗粒、所述第二AAV载体颗粒和所述第三AAV载体颗粒共感染细胞促进所述外源多肽的所述第一部分与所述外源多肽的所述第二...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于将外源多肽递送至细胞的方法，所述方法包括使所述细胞接触：
2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一核酸和所述第二核酸包含肌肉特异性表达盒(msec)。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述分裂内含肽是天然存在的分裂内含肽。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述分裂内含肽是基因修饰的分裂内含肽。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述分裂内含肽的基因修饰选自针对在哺乳动物细胞中的表达和/或稳定性的密码子优化、所述分裂内含肽的缩短或延长，或改变所述分裂内含肽中的编码氨基酸以更紧密地匹配待递送的所述外源蛋白的序列。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述外源多肽的所述第一部分和所述第二部分的大小基本上相同。
7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述外源多肽的所述第一部分和所述第二部分的大小相差不超过50个氨基酸。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述外源多肽包含来自所述分裂内含肽的少于四个氨基酸的足迹。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述外源多肽包含来自所述分裂内含肽的3个或更少氨基酸的足迹。
10.如权利要求9所述的方法，其中将所述外源多肽的所述第一部分和所述第二部分分开的分裂位点选择在具有与所述分裂内含肽足迹相同的序列的位点处，从而产生不含来自所述分裂内含肽的额外氨基酸的所述外源多肽。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述外源多肽是治疗性多肽。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述治疗性多肽选自肌营养不良蛋白、微型肌营养不良蛋白、utrophin和dysferlin、伴肌动蛋白、肌联蛋白、肌球蛋白、含血影蛋白重复的核包膜蛋白1(syne-1)、肌营养不良蛋白聚糖、atp合酶、凝血因子iix、核纤层蛋白a/c、甲状腺球蛋白、表皮生长因子受体(egfr)、α和/或β血影蛋白、雷帕霉素的肌肉靶标(mtor)以及利阿诺定受体1。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述微型肌营养不良蛋白大于160kda并且小于全长肌营养不良蛋白。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述治疗性多肽是肌营养不良蛋白，并且所述肌营养不良蛋白外显肽的n端部分在肌营养不良蛋白铰链结构域内或附近与分裂内含肽的n端部分连接。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述铰链结构域包含肌营养不良蛋白的铰链1、2、3或4。
16.如权利要求12所述的方法，其中所述治疗性多肽是肌营养不良蛋白，并且所述肌营养不良蛋白外显肽的n端部分在24个肌营养不良蛋白血影蛋白样重复结构域中的一个内与将螺旋b与螺旋c或螺旋c与螺旋a’连接的环结构域连接。
17.如权利要求12所述的方法，其中所述治疗性多肽是肌营养不良蛋白，并且所述肌营养不良蛋白外显肽的c端部分在肌营养不良蛋白铰链结构域内或附近与所述分裂内含肽的c端部分连接或在24个肌营养不良蛋白血影蛋白样重复结构域中的一个内与将螺旋b与螺旋c或螺旋c与螺旋a’连接的环结构域连接。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述铰链结构域包含肌营养不良蛋白的铰链1、2、3或4。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述外源多肽在所述细胞中具有功能。
20.一种用于将外源多肽递送至细胞的方法，所述方法包括使所述细胞接触：
21.如权利要求20所述的方法，其中所述第一分裂内含肽和所述第二分裂内含肽不交叉剪接。
22.一种蛋白质表达系统，其包含一组aav载体颗粒，所述aav载体颗粒组包括第一aav颗粒和第二aav颗粒，
23.如权利要求22所述的蛋白质表达系统，其中用所述第一aav载体颗粒和所述第二aav载体颗粒共感染细胞促进所述外源多肽的所述第一部分与所述外源多肽的所述第二部分的连接，同时去除所述分裂内含肽的所述第一部分和所述第二部分。
24.如权利要求22或23所述的蛋白质表达系统，其中所述外源多肽的所述第一部分与所述外源多肽的所述第二部分连接，同时去除所述分裂内含肽的所述第一部分和所述第二部分，产生比在单个aav颗粒中能够编码的多肽更大的外源多肽。
25.一种蛋白质表达系统，其包含一组aav载体颗粒，所述aav载体颗粒组包括第一aav颗粒、第二aav颗粒和第三aav颗粒，
26.如权利要求25所述的蛋白质表达系统，其中用所述第一aav载体颗粒、所述第二aav载体颗粒和所述第三aav载体颗粒共感染细胞促进所述外源多肽的所述第一部分与所述外源多肽的所述第二部分的连接，同时去除所述第一分裂内含肽的所述第一部分和所述第二部分，以及所述外源多肽的所述第二部分与所述外源多肽的所述第三部分的连接，同时去除所述第二分裂内含肽的所述第一部分和所述第二部分。
27.如权利要求25或26所述的蛋白质表达系统，其中所述外源多肽的所述第一部分与所述外源多肽的所述第二部分连接，同时去除所述第一分裂内含肽的所述第一部分和所述第二部分，以及所述外源多肽的所述第二部分与所述外源多肽的所述第三部分连接，同时去除所述第二分裂内含肽的所述第一部分和所述第二部分，...
【专利技术属性】
技术研发人员：杰弗里·S·钱伯兰，伊莎姆·塔斯法欧特，
申请(专利权)人：华盛顿大学，
类型：发明
国别省市：
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