【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复(crispr)。具体而言，本专利技术涉及基因编辑融合蛋白，包含编码它们的核酸分子。本专利技术还涉及用于核酸编辑(例如，基因或基因组编辑)的复合物和组合物，其包含本专利技术的融合蛋白，或编码它们的核酸分子。本专利技术还涉及用于核酸编辑(例如，基因或基因组编辑)的方法，其使用包含本专利技术的融合蛋白。
技术介绍
1、成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)和crispr相关(cas)基因(统称为crispr-cas或crispr/cas系统)是古细菌和细菌中针对外来遗传元件而防御特定物种的适应性免疫系统。利用crispr-cas系统，开发了多种基因组工程技术，极大地加速了合成生物学、基因治疗、诊断、植物工程等研究。除了常用的化脓性链球菌cas9(spcas9)之外，目前已开发了其他可替代性的用于基因组编辑的crispr核酸酶。
2、crispr/cas12i属于v-i型系统，是继cas9系统后发现的另一种类型的crispr系统，它识别ttn的pam，该基序位于spacer的5’端。同时cas12i蛋白除了核酸内切酶功能，还具有rna酶的活性，可以将前体crrna(pre-crrna)处理成单个的成熟crrna用于基因编辑，该系统不包括tracrrna，只需要cas12i蛋白和crrna就可以产生特定位点的切割，因此在多基因编辑设计中更为方便。
3、然而，当前的crispr-cas12i系统的编辑效率有待进一步提高。因此，开发一种切割效率更高的新型c
技术实现思路
1、本专利技术的一个方面提供一种基因编辑融合蛋白，包含嵌合cas12i多肽和5’-3’外切核酸酶功能域，所述5’-3’外切核酸酶功能域融合至所述嵌合cas12i多肽。
2、在优选的实施方式中，所述5’-3’外切核酸酶功能域融合至所述嵌合cas12i多肽的n末端和/或c末端。
3、在优选的实施方式中，所述5’-3’外切核酸酶功能域融合至所述嵌合cas12i多肽的c末端。
4、在优选的实施方式中，所述5’-3’外切核酸酶功能域不融合至所述嵌合cas12i多肽的n末端。
5、在优选的实施方式中，所述5’-3’外切核酸酶功能域来自t5噬菌体。
6、在优选的实施方式中，所述5’-3’外切核酸酶功能域包含与seq id no.21所示的氨基酸序列相比具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
7、在优选的实施方式中，所述5’-3’外切核酸酶功能域通过接头多肽融合至所述嵌合cas12i多肽。
8、在另一些实施方式中，本专利技术提供的所述嵌合cas12i多肽，其包含nuc结构域，其中所述nuc结构域来源于第一cas12i多肽的nuc结构域，所述嵌合cas12i多肽的非nuc结构域部分来源于第二cas12i多肽的非nuc结构域部分，所述第一cas12i多肽与所述第二cas12i多肽相比序列同一性不超过80％，并且所述嵌合cas12i多肽能够结合核酸，并且任选地切割所述核酸。
9、在优选的实施方式中，所述嵌合cas12i多肽：(i)包含与seq id no.1或2所示的氨基酸序列相比具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(ii)包含与seq id no.1或2的aa1至897以及aa 1008至1044的氨基酸序列相比具有至少80％序列同一性且与seq id no.1或2的aa 898至1007的氨基酸序列相比具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
10、在优选的实施方式中，所述嵌合cas12i多肽能够结合核酸，并且任选地切割所述核酸，所述嵌合cas12i多肽：(i)包含与seq id no.3至6任一项所示的氨基酸序列相比具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(ii)包含与seq id no.3至6任一项的aa 1至895以及aa 1016至1054的氨基酸序列相比具有至少80％序列同一性且与seq id no.3至6任一项的aa 896至1015的氨基酸序列相比具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
11、在另一些实施方式中，本专利技术提供的所述嵌合cas12i多肽能够结合核酸，并且任选地切割所述核酸，所述嵌合cas12i多肽由n端至c端包含依次连接的第一肽段、第二肽段和第三肽段，其中：所述第一肽段包含与seq id no.1的aa 1至897或seq id no.3的aa 1至895的氨基酸序列相比具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；所述第二肽段包含与seqid no.75至80任一项所示的氨基酸序列相比具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；并且所述第三肽段包含与seq id no.1的aa 1008至1044或seq id no.3的aa 1016至1054的氨基酸序列相比具有至少80％序列同一性氨基酸序列。
12、在一些实施方式中，所述嵌合cas12i多肽被突变以使其具有以下特征：核酸切割活性增强。
13、在一些实施方式中，所述嵌合cas12i多肽，根据seq id no.1所示的序列编号，在n229位置处具有氨基酸取代，优选被赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代，更优选被精氨酸取代；根据seq id no.1所示的序列编号，在k259位置处具有氨基酸取代，优选被赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代，更优选被精氨酸取代；根据seq id no.1所示的序列编号，在q602位置处具有氨基酸取代，优选被赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代，更优选被精氨酸取代；根据seq idno.1所示的序列编号，在y881位置处具有氨基酸取代，优选被赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代，更优选被精氨酸取代；根据seq id no.1所示的序列编号，在g979位置处具有氨基酸取代，优选被赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代，更优选被精氨酸取代。
14、在一些实施方式中，所述嵌合cas12i多肽，根据seq id no.1所示的序列编号，在n229位置处具有氨基酸取代，优选被赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代，更优选被精氨酸取代。
15、在一些实施方式中，所述嵌合cas12i多肽，(i)包含与seq id no.1所示的氨基酸序列相比具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(ii)包含与seq id no.1的aa 1至897以及aa 1008至1044的氨基酸序列相比具有至少80％序列同一性且与seq id no.1或2的aa898至1007的氨基酸序列相比具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；并且，所述嵌合cas12i多肽在n229、k259、q602、y881和g979五个位置中的至少一个处具有氨基酸取代，优选被赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代，更优选被精氨酸取代。
16、在优选的实施方式中，所述基因编辑融合蛋白包含与seq id no.90至100任一项所示的氨基酸序列相比具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
17、在本专利技术的另一个方面提供一种基因本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基因编辑融合蛋白，包含嵌合Cas12i多肽和5’-3’外切核酸酶功能域，所述5’-3’外切核酸酶功能域融合至所述嵌合Cas12i多肽；所述5’-3’外切核酸酶功能域来自T5噬菌体。
2.根据权利要求1所述的基因编辑融合蛋白，所述5’-3’外切核酸酶功能域融合至所述嵌合Cas12i多肽的N末端和/或C末端；
3.根据权利要求1所述的基因编辑融合蛋白，其中所述嵌合Cas12i多肽：
4.根据权利要求3所述的基因编辑融合蛋白，所述嵌合Cas12i多肽能够结合核酸，并且任选地切割所述核酸，所述嵌合Cas12i多肽：
5.根据权利要求3或4所述的基因编辑融合蛋白，所述嵌合Cas12i多肽被突变以使其具有以下特征：核酸切割活性增强；其中所述嵌合Cas12i多肽，根据SEQ ID NO.1所示的序列编号，在N229位置处具有氨基酸取代，优选被赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代，更优选被精氨酸取代；或
6.根据权利要求5所述的基因编辑融合蛋白，其中所述嵌合Cas12i多肽，
7.根据权利要求6所述的基因编辑融合蛋白，所述基因编辑
8.基因编辑系统，其包含：
9.根据权利要求8所述的基因编辑系统，其中所述引导RNA包含与所述靶核酸杂交的引导区段和与所述基因编辑融合蛋白的Cas12i多肽结合的重复区段，并且所述引导RNA不包含且不结合tracrRNA；
10.一种融合多肽，其包含与一个或多个异源多肽融合的基因编辑融合蛋白，所述基因编辑融合蛋白选自权利要求1至7任一项所述的基因编辑融合蛋白；其中所述一个或多个异源多肽独立地为表位标签、核定位信号、报告基因序列、能够与DNA分子或细胞内分子结合的结构域、可检测信号的酶、亚细胞定位和蛋白质转导结构域。
11.一种复合物，其包含权利要求10所述的融合多肽以及引导RNA，所述引导RNA与所述融合多肽复合以引导所述融合多肽结合至靶核酸；优选地，所述引导RNA包含与所述靶核酸杂交的引导区段和与融合多肽结合的重复区段，并且所述引导RNA不包含且不结合tracrRNA；优选地，所述引导RNA的重复区段包含SEQ ID NO.22至29任一项所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO.22至29任一项所示的核苷酸序列相比具有1至10个核苷酸替换、缺失和/或插入的核苷酸序列；优选地，其中所述引导RNA的重复区段为SEQ ID NO.22至29任一项所示的核苷酸序列。
12.一种核酸，其包含编码如权利要求1至7任一项所述的基因编辑融合蛋白或权利要求10所述的融合多肽的多核苷酸；优选地，所述多核苷酸被密码子优化以在原核或真核细胞中表达；优选地，所述多核苷酸包含或为如SEQ ID NO.68至74任一个所示的核苷酸序列。
13.根据权利要求12所述的核酸，其包含引导RNA或编码所述引导RNA的核苷酸序列，所述引导RNA包含重复区段，包含SEQ ID NO.22至29任一项所示的核苷酸序列或与SEQ IDNO.22至29任一项所示的核苷酸序列相比具有1至10个核苷酸替换、缺失和/或插入的核苷酸序列；优选地，其中所述引导RNA的重复区段为SEQ ID NO.22至29任一项所示的核苷酸序列；优选地，所述引导RNA不包含且不结合tracrRNA；优选地，所述核酸是DNA或mRNA。
14.一种载体，其包含权利要求12和/或13所述的核酸；优选地，所述载体是质粒或病毒载体；优选地，所述病毒载体是腺相关病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体或单纯疱疹病毒载体。
15.一种递送系统，包含权利要求1至7任一项所述的基因编辑融合蛋白、权利要求8或9所述的基因编辑系统、权利要求10所述的融合多肽、权利要求11所述的复合物、权利要求12或13所述的核酸、权利要求14所述的载体；优选地，所述递送系统包括脂质体、纳米颗粒或外泌体。
16.一种细胞，其包含权利要求1至7任一项所述的基因编辑融合蛋白、权利要求8或9所述的基因编辑系统、权利要求10所述的融合多肽、权利要求11所述的复合物、权利要求12或13所述的核酸、权利要求14所述的载体、或权利要求15所述的递送系统；优选地，所述细胞是真核细胞；更优选地，所述细胞是人细胞。
17.一种组合物或试剂盒，其包含权利要求1至7任一项所述的基因编辑融合蛋白、权利要求8或9所述的基因编辑系统、权利要求10所述的融合多肽、权利要求11所述的复合物、权利要求12或13所述的核酸、权利要求14所述的载体、权利要求1...
【技术特征摘要】
1.基因编辑融合蛋白，包含嵌合cas12i多肽和5’-3’外切核酸酶功能域，所述5’-3’外切核酸酶功能域融合至所述嵌合cas12i多肽；所述5’-3’外切核酸酶功能域来自t5噬菌体。
2.根据权利要求1所述的基因编辑融合蛋白，所述5’-3’外切核酸酶功能域融合至所述嵌合cas12i多肽的n末端和/或c末端；
3.根据权利要求1所述的基因编辑融合蛋白，其中所述嵌合cas12i多肽：
4.根据权利要求3所述的基因编辑融合蛋白，所述嵌合cas12i多肽能够结合核酸，并且任选地切割所述核酸，所述嵌合cas12i多肽：
5.根据权利要求3或4所述的基因编辑融合蛋白，所述嵌合cas12i多肽被突变以使其具有以下特征：核酸切割活性增强；其中所述嵌合cas12i多肽，根据seq id no.1所示的序列编号，在n229位置处具有氨基酸取代，优选被赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代，更优选被精氨酸取代；或
6.根据权利要求5所述的基因编辑融合蛋白，其中所述嵌合cas12i多肽，
7.根据权利要求6所述的基因编辑融合蛋白，所述基因编辑融合蛋白包含与seq idno.90至100任一项所示的氨基酸序列相比具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
8.基因编辑系统，其包含：
9.根据权利要求8所述的基因编辑系统，其中所述引导rna包含与所述靶核酸杂交的引导区段和与所述基因编辑融合蛋白的cas12i多肽结合的重复区段，并且所述引导rna不包含且不结合tracrrna；
10.一种融合多肽，其包含与一个或多个异源多肽融合的基因编辑融合蛋白，所述基因编辑融合蛋白选自权利要求1至7任一项所述的基因编辑融合蛋白；其中所述一个或多个异源多肽独立地为表位标签、核定位信号、报告基因序列、能够与dna分子或细胞内分子结合的结构域、可检测信号的酶、亚细胞定位和蛋白质转导结构域。
11.一种复合物，其包含权利要求10所述的融合多肽以及引导rna，所述引导rna与所述融合多肽复合以引导所述融合多肽结合至靶核酸；优选地，所述引导rna包含与所述靶核酸杂交的引导区段和与融合多肽结合的重复区段，并且所述引导rna不包含且不结合tracrrna；优选地，所述引导rna的重复区段包含seq id no.22至29任一项所示的核苷酸序列或与seq id no.22至29任一项所示的核苷酸序列相比具有1至10个核苷酸替换、缺失和/或插入的核苷酸序列；...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈柏洪，胡洋，林少芸，马肖杰，徐文倡，余嘉俊，谭文琼，吴幼玉，余宇霖，孙金帅，
申请(专利权)人：微光基因苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：
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