【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，特别涉及一种续断三萜合成酶daosc05基因及应用。
技术介绍
1、川续断(dipsacus asperoides)为川续断科川续断属植物，是我国大宗中药材续断的基源植物，富含大量的齐墩果烷型三萜皂苷，川续断皂苷vi是其中的典型代表，是2020版中国药典中续断药材的指标性成分，现代医学研究发现其不仅具有止血、促进骨损伤愈合、降低子宫收缩、补肝肾等功能，还是一种阿尔茨海默病相关神经炎症的潜在药物，应用前景十分广泛，另外的川续断三萜皂苷川续断皂苷b和灰毡毛忍冬皂苷b等也具有重要的药用价值。
2、目前续断皂苷vi来源主要还是从川续断中提取，尽管有些川续断中川续断皂苷vi含量不低，有些川续断植株能达到10％以上，但在有些植株中却又远远达不到药典的要求，因此这种获取方式容易受到植物方面带来的限制，并且不利于川续断资源的可持续发展，要打破这一现状合成生物学是不错的选择，但要采取合成生物学的方式生产川续断中的川续断皂苷vi等三萜皂苷，就需要对川续断三萜皂苷的合成路径进行解析，但目前关于川续断中川续断三萜皂苷合成过程中涉及的关键酶研究较少，急需对川续断中三萜皂苷合成的关键基因进行挖掘，这不仅可以为川续断中川续断皂苷vi及其他川续断三萜皂苷的微生物工厂化生产奠定基础，同时也为解析川续断皂苷vi合成的调控机制和分子辅助育种提供依据。
技术实现思路
1、针对上述问题，本专利技术的目的是提供一种川续断三萜合成酶daosc05基因。
2、为实现上述目的，本专利技术
3、一种续断三萜合成酶daosc05基因，所述续断三萜合成酶daosc05基因的核酸序列如seq id no：1所示。
4、所述的续断三萜合成酶daosc05基因所编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seqid no：2所示。
5、本专利技术还提供了一种所述续断三萜合成酶daosc05基因在制备β-香树脂醇中的应用。
6、作为优选，制备β-香树脂醇的方法包括以下步骤：
7、(1)cdna模板的制备；
8、(2)基因扩增及回收；
9、(3)基因重组载体的构建与鉴定；
10、(4)测序与保菌；
11、(5)酵母感受态的制备和醋酸锂转化；
12、(6)阳性菌株的筛选；
13、(7)酵母诱导表达及产物提取。
14、所述步骤(1)中cdna模板的制备包括以下步骤：取川续断的新鲜根、茎、叶，切片后液氮速冻，进行rna提取，使用反转录试剂盒将rna反转录成cdna，-20℃保存备用；所述步骤(2)中以所述反转录得到的cdna为模板，采用dna聚合酶进行基因扩增，加入cdna 2μl，2xphantamax master mix25μl，上、下游引物各2μl，ddh2o补足至50μl，扩增体系为：95℃、3min，95℃、15s，55℃、15s，72℃、1min，36个循环；72℃、5min。
15、所述步骤(3)中基因重组载体的构建与鉴定包括以下步骤：载体线性化、重组转化和菌水检测；所述步骤(4)中测序与保菌包括以下步骤：将所述菌水检测为阳性的菌落加入到含氨苄的lb培养基培养，采用试剂盒将质粒提取，测序，保存。
16、所述步骤(5)中酵母感受态的制备和醋酸锂转化包括以下步骤：将gil77菌株在ypd平板中进行划板活化，挑取活化后的单菌落接种与含有血红素、麦角固醇和吐温80的ypd培养基中培养，离心收集菌体，重悬，离心，收集菌体，重悬，离心，弃上清加转化体系，转化体系配比：peg3350(50％(w/v过滤除菌))240μl、liac1.0m36μl、ssdna 10μl、需要转化的质粒2.5μl和水74μl，转化总体系360μl；用混合好的转化体系重悬菌体，于30℃培养箱中保温20min，42℃热激40min涂板，倒置放于30℃培养箱中培养2-3天。
17、所述步骤(6)中阳性菌株的筛选包括以下步骤：挑取转化平板上长出的单菌落于液体培养基中培养，离心，弃上清，加入100μl含200mm醋酸锂，1％sds细胞裂解液，涡旋混匀，孵育，加入无水乙醇洗涤，离心，弃上清，挥干乙醇，加入50μlddh2o，吹打混匀，离心，取上清作为模板进行后续菌水pcr，菌水pcr，pcr程序：95℃、3min；95℃、30s，55℃、15s，72℃、1min，30个循环；72℃、5min。
18、所述步骤(7)中酵母诱导表达及产物提取包括以下步骤：将菌液接种到不含尿嘧啶的sc-ura培养基，补充麦角甾醇、血红素和tween 80培养；培养2天后，将葡萄糖换成半乳糖，诱导，离心，收集细胞，用磷酸钾缓冲液重悬，补充葡萄糖和血红素培养，离心，收集细胞，用裂解液孵育，乙酸乙酯萃取，收集萃取液蒸干。
19、本专利技术具有以下有益效果：
20、川续断中拥有丰富的齐墩果烷型皂苷，有些植株根中的川续断皂苷vi单体皂苷的含量更是能达到10％以上，这说明该条路径上的酶的催化效率是很高的。在本次研究中发现川续断中存在β-as为daosc05，它负责川续断皂苷vi骨架构建的阶段，没有这一步就没有后续的川续断皂苷vi的产生，所以这个步骤对于整个途径来说是重中之重。川续断皂苷vi在川续断中被大量合成也得益于这个酶，所以它们的催化效率可能是非常高的，目前催化效率最高的β-as是光果甘草的ggβ-as，生成齐墩果烷型皂苷的酵母底盘都是采用的这一个基因，但考虑到甘草中三萜皂苷的含量并没有川续断的高，所以川续断中daosc05的催化效率也许能超过ggβ-as，代替它成为合成齐墩果烷型皂苷的新β-as，另外由于daosc05参与了川续断主要活性成分川续断皂苷vi的生物合成，因此它还可作为川续断的分子辅助育种的重要标记基因。
21、本专利技术续断三萜合成酶daosc05基因，是从川续断中通过转录组测序及生物信息学技术，经大量实验后筛选后得以鉴定出来的；采用rna试剂后提取川续断的rna，并反转成cdna后进行pcr扩增获得。续断三萜合成酶daosc05基因的扩增引物如下所示：
22、5'f：cggtttgtattacttcttattc
23、3'r：gcgtgaatgtaagcgtgac
24、此外，与载体pyes2-ura进行同源重组时，daosc05基因则需要使用带同源壁的引物进行扩增及回收，带同源壁的引物如下：
25、5'f：cttggtaccgagctcggatccatgtggagactgaagatagcag；
26、3'r：cacactggcggccgttactagttaagaaagacatttttggttggatg。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种续断三萜合成酶DaOSC05基因，其特征在于，所述续断三萜合成酶DaOSC05基因的核酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的续断三萜合成酶DaOSC05基因所编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.一种权利要求1所述续断三萜合成酶DaOSC05基因在制备β-香树脂醇中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，制备β-香树脂醇的方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中cDNA模板的制备包括以下步骤：取川续断的新鲜根、茎、叶，切片后液氮速冻，进行RNA提取，使用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，-20℃保存备用；所述步骤(2)中以所述反转录得到的cDNA为模板，采用DNA聚合酶进行基因扩增，加入cDNA 2μl，2xphantaMax Master mix25μl，上、下游引物各2μL，ddH2O补足至50μL，扩增体系为：95℃、3min，95℃、15s，55℃、15s，72℃、1min，36个循环；72℃、5m
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中基因重组载体的构建与鉴定包括以下步骤：载体线性化、重组转化和菌水检测；所述步骤(4)中测序与保菌包括以下步骤：将所述菌水检测为阳性的菌落加入到含氨苄的LB培养基培养，采用试剂盒将质粒提取，测序，保存。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(5)中酵母感受态的制备和醋酸锂转化包括以下步骤：将GIL77菌株在YPD平板中进行划板活化，挑取活化后的单菌落接种与含有血红素、麦角固醇和吐温80的YPD培养基中培养，离心收集菌体，重悬，离心，收集菌体，重悬，离心，弃上清加转化体系，转化体系配比：PEG3350 240μl、LiAc 1.0M 36μl、SSDNA10μl、需要转化的质粒2.5μl和水74μl，转化总体系360μl；用混合好的转化体系重悬菌体，于30℃培养箱中保温20min，42℃热激40min涂板，倒置放于30℃培养箱中培养2-3天。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(6)中阳性菌株的筛选包括以下步骤：
9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(7)中酵母诱导表达及产物提取包括以下步骤：将菌液接种到不含尿嘧啶的SC-Ura培养基，补充麦角甾醇、血红素和Tween80培养；培养2天后，将葡萄糖换成半乳糖，诱导，离心，收集细胞，用磷酸钾缓冲液重悬，补充葡萄糖和血红素培养，离心，收集细胞，用裂解液孵育，乙酸乙酯萃取，收集萃取液蒸干。
...【技术特征摘要】
1.一种续断三萜合成酶daosc05基因，其特征在于，所述续断三萜合成酶daosc05基因的核酸序列如seq id no：1所示。
2.根据权利要求1所述的续断三萜合成酶daosc05基因所编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如seq id no：2所示。
3.一种权利要求1所述续断三萜合成酶daosc05基因在制备β-香树脂醇中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，制备β-香树脂醇的方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中cdna模板的制备包括以下步骤：取川续断的新鲜根、茎、叶，切片后液氮速冻，进行rna提取，使用反转录试剂盒将rna反转录成cdna，-20℃保存备用；所述步骤(2)中以所述反转录得到的cdna为模板，采用dna聚合酶进行基因扩增，加入cdna 2μl，2xphantamax master mix25μl，上、下游引物各2μl，ddh2o补足至50μl，扩增体系为：95℃、3min，95℃、15s，55℃、15s，72℃、1min，36个循环；72℃、5min。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中基因重组载体的构建与鉴定包括以下步骤：载体线性化、重组转化和菌水检测；所述步骤...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁艳丽，杨润，魏艳萍，张广辉，和四梅，杨生超，赵秀，王硕，杨和团，张晓东，赵艳，王芳，付昌昊，杨楠，李珊珊，张丽纯，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。