【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及r-spondin蛋白的重组变体及其作为药物的用途，特别是用于治疗糖尿病。
技术介绍
1、在过去的几十年中，糖尿病已经成为最普遍的代谢性疾病之一，其流行程度已影响到全球近9％的人口(who，2016)。到2049年，受糖尿病影响的人数预计达到6亿。糖尿病的特征在于高血糖水平，其在大多数情况下是由胰腺无法分泌足够量的胰岛素所致。1型糖尿病(t1d)是由产生胰岛素的β-细胞在自身免疫的介导下遭到破坏所致，而2型糖尿病(t2d)则是由对胰岛素作用的抵抗和随时间推移的最终β-细胞衰竭/损失所致。
2、目前的糖尿病的治疗无法严格地恢复正常血糖，并且在t1d的情况下，甚至表现为相当姑息性的，通过外源性胰岛素注射替代有缺陷的胰岛素分泌。因此，用新的功能性β-细胞补充胰腺和/或维持剩余β-细胞的健康代表了治疗这两种病症的关键策略。然而，迄今为止，没有预防胰腺β-细胞损失或诱导胰腺β-细胞增殖的可用治疗，尤其是在患有1型糖尿病的人患者中。
3、rspo1属于富含半胱氨酸的分泌蛋白家族，也包括rspo2、rspo3和rspo4。它们共享共同的结构架构，包括如图1中公开的四个结构和功能上不同的结构域。在n末端，信号肽序列确保r-spondin蛋白正确进入经典分泌途径。成熟的分泌形式含有两个氨基末端富含半胱氨酸的弗林蛋白酶样重复序列(fu1和fu2)，这对于与r-spondin特异性受体lgr(leucine-rich repeat-containing g-protein coupled receptor，含有富含亮
4、尽管cwnt通路可能参与胰腺的成熟和功能而引起了人们极大的兴趣(scheibneret al 2019,curr opin cell biol.61:48-55)，但是r-spondin蛋白在该器官中的作用和贡献还没有得到充分研究。
5、体外分析报道，在rspo1的存在下，β-细胞的增殖和功能在min6肿瘤衍生细胞系中增加(wong,v.s.,yeung,a.,schultz,w.&brubaker,p.l.r-spondin-1is a novel beta-cell growth factor and insulin secretagogue.j biol chem 285,21292-21302,doi:10.1074/jbc.m110.129874(2010))。然而，来自同一研究小组的更多最新研究报告了矛盾的结果：小鼠中rspo1的缺陷与增加的β-细胞团(β-cell mass)和增强的血糖控制有关(wong,v.s.,oh,a.h.,chassot,a.a.,chaboissier,m.c.&brubaker,p.l.diabetologia54,1726-1734,doi:10.1007/s00125-011-2136-2(2011)and chahal et al 201,pancreasvol 43(1)pp 93-102)。
6、与后一研究相反，pct/ep2021/050289报道了重组rspo1蛋白治疗在糖尿病小鼠模型中诱导功能性胰腺β-细胞的体内增殖，改善葡萄糖耐量，并增加葡萄糖刺激的胰岛素分泌(gsis)。此外，该研究提示在接近完全的β-细胞消融后，施用rspo1蛋白可以诱导剩余的β-细胞增殖并重建能够维持正常血糖的功能性β-细胞团。最后，该研究显示rspo1还可以诱导人β-细胞增殖，从而为使用重组rspo1蛋白治疗和预防人糖尿病开辟了新的意想不到的途径。
7、用于受体结合和生物活性的rspo1关键残基由例如wang et al.genes&development 27:1339-1344,2013；xie et al.embo reports vol 14|no 12|2013；xu etal.the journal of biological chemistry vol.290,no.4,pp.2455-2465,january23,2015.等描述。用于znrf3和lgr4受体结合和生物活性的关键残基标出并报道于图1中。
8、目前仍然需要进一步改进rspo1衍生蛋白，以优化其用作生物药的可开发特性和药理学特性。
9、因此，本公开的一个目的是提供r-spondin蛋白的新型重组变体，其用作药物，例如用于治疗糖尿病。
技术实现思路
1、专利技术详述
2、定义
3、为了更容易理解本公开，首先定义了某些术语。在整个专利技术详细描述中列出了额外的定义。
4、术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和非天然氨基酸(在本文中也称为“非天然存在的氨基酸”)，例如功能类似于天然存在的氨基酸的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及随后经修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，例如与氢结合的α碳、羧基、氨基和r基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物可以具有修饰的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.R-spondin蛋白的重组变体，其包含以下FU1、FU2、TSP和BR结构域，其中
2.根据权利要求1所述的R-spondin蛋白的重组变体，其包含具有至少H108K和N109D氨基酸取代的Rspo1 FU1和Rspo1 FU2结构域，优选所述变体包含SEQ ID NO:66或基本上由SEQ ID NO:66组成。
3.根据权利要求1或2所述的重组变体，当分别与相应的SEQ ID NO:5的人Rspo1 FU1结构域和SEQ ID NO:6的Rspo1 FU2结构域比对时，其在每个FU1或FU2结构域中具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组变体，其包含在Rspo1的区域21-33内，或在Rspo2、Rspo3或Rspo4的等效区域内的前10-14个N末端氨基酸的缺失，典型地是Rspo1的残基21-31的缺失，优选包含SEQ ID NO:24的蛋白质或由SEQ ID NO:24的蛋白质组成。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组变体，其至少包含在SEQ ID
6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组变体，其中所述变体不包含在FU2和TSP结构域之间的N-糖基化位点，例如，其包含Rspo1的N137残基或Rspo2、Rspo3、或Rspo4的等效残基中的突变，以抑制该位置处的N-糖基化，优选所述重组变体包含SEQ ID NO:22或基本上由SEQ ID NO:22组成。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的重组变体，其中所述FU1结构域与SEQ ID NO:9的Rspo2 FU1结构域100％相同并且所述FU2选自Rspo1、Rspo3、Rspo4的FU2结构域或其功能性变体，所述功能性变体具有至少保持与LGR4相同的结合亲和力的氨基酸取代，优选所述变体包含SEQ ID NO:9的Rspo2 FU1结构域和SEQ ID NO:6的Rspo1 FU2结构域，以及任选地SEQ ID NO:7的Rspo1 TSP结构域和SEQ ID NO:8的Rspo1 BR结构域，更优选地，所述变体包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26或基本上由SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26组成。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的重组变体，其表现出与SEQ ID NO:41的Rspo1蛋白至少相似水平的以下一种或多种特性：
9.Fc融合蛋白，其包含权利要求1-8中任一项所述的重组变体，其中Fc片段直接或经由肽接头间接融合至所述重组变体，优选地，所述Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:42、43、92或93或基本上由SEQ ID NO:42、43、92或93组成。
10.权利要求1-8中任一项所述的重组变体或权利要求9所述的融合蛋白，其用作药物，特别是用于治疗糖尿病，更优选I型或II型糖尿病。
11.核酸，其编码权利要求1-8中任一项所述的重组变体或权利要求9所述的融合蛋白。
12.载体，其包含权利要求11所述核酸。
13.宿主细胞，其包含权利要求11所述核酸。
14.用于制备权利要求1-8中任一项所述的重组变体或权利要求9所述的融合蛋白的方法，其包括(i)在用于表达所述重组变体或融合蛋白的条件下，培养权利要求13所述的宿主细胞，(ii)回收所述重组变体或融合蛋白，(iii)任选地，纯化所述重组变体或融合蛋白。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.r-spondin蛋白的重组变体，其包含以下fu1、fu2、tsp和br结构域，其中
2.根据权利要求1所述的r-spondin蛋白的重组变体，其包含具有至少h108k和n109d氨基酸取代的rspo1 fu1和rspo1 fu2结构域，优选所述变体包含seq id no:66或基本上由seq id no:66组成。
3.根据权利要求1或2所述的重组变体，当分别与相应的seq id no:5的人rspo1 fu1结构域和seq id no:6的rspo1 fu2结构域比对时，其在每个fu1或fu2结构域中具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组变体，其包含在rspo1的区域21-33内，或在rspo2、rspo3或rspo4的等效区域内的前10-14个n末端氨基酸的缺失，典型地是rspo1的残基21-31的缺失，优选包含seq id no:24的蛋白质或由seq id no:24的蛋白质组成。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组变体，其至少包含在seq id no:5的人rspo1fu1结构域中r66处或在人rspo2、rspo3或rspo4 fu1结构域序列中的等效精氨酸残基处的氨基酸取代，所述氨基酸取代降低或消除znrf3结合，典型地所述变体包含seq id no:5的rspo1 fu1结构域，其具有降低或消除znrf3结合的残基r66的单氨基酸取代，典型地为r66a，例如，所述重组变体包含seq id no:23或基本上由seq id no:23组成。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组变体，其中所述变体不包含在fu2和tsp结构域之间的n-糖基化位点，例如，其包含rspo1的n137残基或rspo2、rspo3、或rspo4的等效残基中的突变，以抑制该位置处的n-糖基化，优选所述重组变体包含seq id no:22或基本上由...
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