一种单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种单克隆抗体及其应用。该单克隆抗体由轻链和重链组成，所述重链的可变区的氨基酸残基序列如序列表中序列１所示，所述轻链的可变区的氨基酸残基序列如序列表中序列２所示。本发明专利技术将抗ＣＴＬＡ－４抗体与抗４－１ＢＢ抗体联用构建成抗人４－１ＢＢ和ＣＴＬＡ－４的单克隆抗体，实验结果表明，上述单克隆抗体具有抗体结构，可以分别与人４－１ＢＢ和ＣＴＬＡ－４结合。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种单克隆抗体及其应用。
技术介绍
理论上讲，人体每天都有大量细胞发生突变，但只有极少数突变的细胞能够继 续分裂生长，并且逃脱免疫系统的监视和攻击而形成肿瘤。肿瘤来源于机体自身突 变的细胞，大部分突变细胞的成分与机体正常细胞的成分相同，只有极少数异常表 达的蛋白质和畸形多糖具有免疫原性。由于肿瘤细胞之间存在免疫原性的差异，那 些免疫原性较强的肿瘤可以诱导有效的抗肿瘤免疫应答，易被机体消灭；而那些免 疫原性相对较弱的肿瘤，则能逃脱免疫系统的监视而选择性地增殖，这一过程称为 免疫选择；经过不断的选择，肿瘤的免疫原性越来越弱。机体有多种抗肿瘤免疫机制，包括细胞免疫和体液免疫，又可分为特异性免疫 和非特异性免疫。抗肿瘤免疫以细胞免疫为主，其中具有免疫记忆功能和特异性的 主要是T细胞， 一直受到人们的重视，而非特异性抗肿瘤免疫细胞-自然杀伤细胞 (NK)也日益受到人们的重视。T细胞主要有两类:CD4+T辅助细胞和CD8+细胞毒性 T细胞(CTL) 。 CD4+T细胞在接受专职抗原提呈细胞(APC)上的MHC抗原复合物和 共刺激分子双重信号后，发生克隆性增值，并释放出多种细胞因子，其中主要为 白细胞介素2 (IL-2) 、 g干扰素(INF-g)、肿瘤坏死因子(TNF)和淋巴毒素(LT)。 这些细胞因子在调节与活化CTL、巨噬细胞和B细胞的抗肿瘤效应中起重要作用。 CD8+ CTL也是在双重信号作用下被活化和克隆增值，CTL必须与靶细胞直接接触才 能产生杀伤作用。目前的研究认为，CTL杀伤作用方式有三种①CTL与靶细胞接 触产生脱颗粒作用，排出穿孔素(perferin)插入到靶细胞膜上，并使其形成通道，而 粒酶(granzymes)、 TNF、分泌性ATP等效应分子进入靶细胞，导致其死亡。其中， 穿孔素造成靶细胞膜损伤，粒酶使DNA断裂，引起细胞凋亡(PCD)。②CTL激活 后表达Fas配体(FasL)，它可被释放到胞外与靶细胞表面的Fas分子结合，传导死 亡信号进入胞内，活化靶细胞内的DNA降解酶，引起靶细胞凋亡。激活白介素lb 转换酶(ICE)或与ICE相关的蛋白酶，引起细胞凋亡。③上述两种方式共存。CD8+CTL 杀伤活性约有2/3来自于穿孔素途径，而Fas/FasL诱导的PCD约占1/3。T细胞的活化除了通过T细胞受体(TCR)和CD3复合物对抗原进行识别外，还 必须有共刺激分子(costimulator)参与。在T细胞激活诱导阶段缺乏共刺激信号，不 仅不能活化T细胞，还会引起T细胞克隆特异性无反应性，导致免疫耐受。共刺激 分子B7是目前公认的第二刺激信号，属于免疫球蛋白超家族成员，最初发现于活 化的B细胞上，它也表达于树突状细胞和活化的巨噬细胞上，除B细胞来源的肿瘤 外，其他肿瘤很少表达B7。共刺激分子的缺乏也是肿瘤的弱免疫原性的重要因素。 B7有两种受体存在于T细胞表面，CD28低亲和力受体和CTLA-4高亲和力受体。CD28 是免疫球蛋白超家族成员，是分子量为44kD的同源二聚体，在959&的CD4+T淋巴细 胞、50% CD8+T淋巴细胞及CD4+ CD8+双阳性的胸腺细胞表面皆有组成性表达。CTLA-4 为CD28的同源分子，他们共表达于活化的T细胞表面。CTLA-4的表达量虽然比CD28 低，但它与B7的亲和力是CD28的20倍。B7: CD28通路为IL-2的产生提供了关键 信号。B7与T细胞上的CD28结合产生阳性信号，增强免疫应答；B7与CTLA-4结 合则产生阴性信号，封闭了CD28依赖的T细胞激活，下调免疫反应。4-lBB/4-lBBL共刺激途径是近几年发现的，4-1BB (CDwl37)是肿瘤坏死因子受 体超家族成员，主要表达于T细胞上。其高亲和力配体4-lBBL表达于巨噬细胞和 活化的B细胞上。4-1BBL或抗4-1BB抗体与T细胞的4-1BB结合后可诱导T细胞的 活化与增殖。4-lBB既能协同CD28对T细胞的共刺激作用，也能不依赖于CD28而 发挥共刺激效应。由于共刺激分子在T细胞活化中的关键作用，利用抗体刺激这些分子，从而打 破免疫细胞对肿瘤细胞的免疫不反应性，成为开发抗肿瘤药物的一个重要方向。在 研的药物中CTLA-4抗体tremelimumab和ipilimumab受到业界的关注。tremelimumab 由辉瑞公司开发，ipilimumab由百时美施贵宝和Medarex公司开发。tremelimumab 和ipilimumab目前都已处于临床试验的最后阶段，数百名黑素瘤病人加入了该试验。根据4-1BB/4-1BBL共刺激通路，应用抗4-1BB抗体在小鼠体内可直接活化T 细胞，根除某些已种植的大肿瘤。小鼠实验表明应用抗4-1BB单克隆抗体可根除 免疫原性差的Agl04A肉瘤和高成瘤性的P815肥大细胞瘤。通过激活免疫细胞治疗肿瘤的主要副作用是自身的免疫反应，抗CTLA-4抗体 的临床实验中，肿瘤病人出现较强的自身免疫病。但抗4-1BB抗体不但具有激活 CD8+T细胞的作用，还有抑制B细胞功能，从而表现出抑制自身免疫性疾病的效果。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种单克隆抗体。本专利技术所提供的单克隆抗体名称为anti-4-IBB-CTLA4-IgG2a，含有重链和轻 链；所述重链的可变区的氨基酸残基序列如序列表中序列l所示，所述轻链的可变 区的氨基酸残基序列如序列表中序列2所示。具体的，上述单克隆抗体中，所述重链的恒定区为同种型(isotype)鼠lgG2a 的恒定区，所述轻链的恒定区为鼠的Kappa的恒定区。所述单克隆抗体anti-4-IBB-CTLA4-IgG2a的重链的氨基酸残基序列如序列表 中序列3所示，所述单克隆抗体anti-4-IBB-CTLA4-IgG2a的轻链的氨基酸残基序 列如序列表中序列4所示。上述单克隆抗体的编码基因也属于本专利技术的保护范围。用木瓜蛋白酶酶解上述单克隆抗体得到的Fab片段也属于本专利技术的保护范围。 上述Fab片段的编码基因也属于本专利技术的保护范围。含有上述单克隆抗体或Fab片段的编码基因的重组表达载体、表达盒、转基因 细胞系或重组菌也属于本专利技术的保护范围。本专利技术的另一个目的是提供一种由上述单克隆抗体衍生的人源化抗体。所述人源化抗体由轻链和重链组成，所述重链可变区的氨基酸残基序列如序列 表中序列1所示，所述轻链可变区的氨基酸残基序列如序列表中序列2所示。本专利技术将抗CTLA-4抗体与抗4-1BB抗体联用构建成抗人4-1BB和CTLA-4的单 克隆抗体，实验结果表明，上述单克隆抗体具有抗体结构，能够分别与人4-1BB和 CTLA-4特异性结合。 附图说明图1为ELISA检测单克隆抗体anti-4-IBB-CTLA4-IgG2a与人CTLA-4的结合曲线图2为流式细胞仪检测单克隆抗体anti-4-lBB-CTLA4-IgG2a与展示在酵母表面的人4-1BB胞外段的结合曲线具体实施例方式下述实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1、单克隆抗体anti-4-IBB-CTLA4-IgG2a的制备1、单克隆抗体anti-4-IBB-CTLA4-IgG2a重链及轻链的获得分别人工合成抗CTLA-4抗体和抗4-1BB抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单克隆抗体，由轻链和重链组成，其特征在于：所述重链的可变区的氨基酸残基序列如序列表中序列１所示，所述轻链的可变区的氨基酸残基序列如序列表中序列２所示。

【技术特征摘要】
CN 2008-7-15 200810116696.91、一种单克隆抗体，由轻链和重链组成，其特征在于所述重链的可变区的氨基酸残基序列如序列表中序列1所示，所述轻链的可变区的氨基酸残基序列如序列表中序列2所示。2、 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体重链的 氨基酸残基序列如序列表中序列3所示，所述单克隆抗体轻链的氨基酸残基序列如 序列表中序列4所示。...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐捷，刘阳，陈列平，朱卫彬，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]