【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种人脐带间充质干细胞来源的外泌体及其在糖尿病肾病治疗药物中的应用。
技术介绍
1、糖尿病肾病(diabelic kidney disease，dkd)是指由糖尿病引起的慢性肾脏病，20% ~40%的糖尿病患者合并dkd.dkd起病隐匿，进展迅速，已成为中老年人发生终末期肾脏疾病(eskd)、心血管事件和死亡的首要病因。dkd缺乏特异性治疗手段。目前国际指南推荐的一线用药为acei/arb、sglt-2两大类，能有效减少肾病复合终点事件如肌醉翻倍、eskd的发生风险。但仍有很多dkd患者出现进行性的肾脏损害。因此，迫切需要找到新的治疗手段和策略来解决这一临床难题。
2、作为再生医学的重要组成部分，干细胞技术已显示出巨大的前景。相较于其他干细胞，间充质干细胞 (mesen-chymalstem cells，mscs)因具有多向分化、自我更新、归巢能力和免疫调节能力，在肾脏疾病治疗中体现出明显优势。mscs可以从人体的不同组织中获取，例如骨髓、脂肪组织、脐带、子官内膜息肉和血液等。人脐带间充质干细胞(humanumbilical cord mesenchymal stem cells, hucmscs得益于其非侵入性分离方法，具备无伦理问题、免疫原性较低、自我更新能力更快、倍增时间稳定和增殖效力高等特点，广泛应用于干细胞疗法和再生医学领域。然而，干细胞治疗法仍有较大的局限性，如生物活性不稳定、过度分化和致瘤性等”，这些缺点限制了干细胞本身的临床使用因此研究者们在不断寻找更佳的替代治疗策
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种使用蔗糖重水垫方法提取人脐带间充质干细胞培养上清中的外泌体，并将其用于糖尿病肾病（dkd）小鼠治疗具有显著作用。
2、本专利技术提供一种人脐带间充质干细胞外泌体的分离与鉴定方法：
3、所有参与者都提供了使用脐带的知情同意书，该研究获得了济宁医学院附属医院（许可证编号：2020c023）的伦理批准。在无菌条件下取出脐带浸入无血清的dmem/f12培养基中用含有青霉素和硫酸链霉素的pbs缓冲溶液洗涤去除残存血，剔除动静脉和外包膜将脐带剪碎至1mm x 1mm x 1 mm 大小。分别采用贴壁细胞培养法和酶消化法先后经0.1%胶原酶和0.25%胰酶消化)pbs洗涤，以1.0 x 106接种到25cm培养瓶,37℃、5% co2、饱和湿度条件下细胞培养箱中培养1周左右更换培养液。至 10~14天单层贴壁细胞接近80%汇时,0.25%胰蛋白酶消化,1:2 传代以后随细胞扩增均于80%左右汇合时按1:2持续体外传代培养。收集细胞培养上清，在1500 g离心5分钟以消除细胞碎片后，上清液在4°c继续以100000g离心1小时，以分离最终的外泌体。采用透射电子显微镜检查分离的外泌体的形态。通过免疫印迹分析评估外泌体表面上cd81和cd63的存在。
4、本专利技术还提供hucmsc-exo作为药物应用于对dkd小鼠进行治疗：
5、在本专利技术中，使用自发性糖尿病小鼠（db/db小鼠）诱导糖尿病肾病模型，db/m小鼠作为对照。10只雄性db/db小鼠和5只雄性db/m小鼠，约6周龄，体重约50±10g，购自江苏集萃药康生物技术有限公司。这些小鼠经过7天的适应期，并以spf级标准饲养在济宁医学院动物实验中心。所有动物实验均符合arrive指南，并根据1986年《英国动物（科学程序）法》和相关指南进行。模型组接受高糖高脂饮食，而对照组则维持标准饮食。每天更换垫料，定期更换水源，并根据需要补充饲料。在10周的实验过程中，每周监测血糖水平，定期收集尿液以评估微量白蛋白水平。当模型组小鼠表现出精神状态减弱、毛发稀疏粗糙、食物和水消耗显著增加、持续空腹血糖水平≥16.7 mmol/l以及24小时尿白蛋白排泄率显著高于nc组等特征时，即诱导成功糖尿病肾病小鼠模型。随后，将成功建模的糖尿病肾病小鼠随机分为3组：db/m正常小鼠组、糖尿病肾病组、外泌体治疗糖尿病肾病组，每组由5只小鼠组成。外泌体治疗组接受每周三次单次剂量为10 mg/kg人脐带间充质干细胞来源的外泌体，采用尾静脉注射的给药方式，持续8周，而糖尿病治疗组和db/m正常组小鼠组通过尾静脉注射相同体积的pbs。注射过程包括将小鼠的尾巴浸入温水中以扩张尾静脉，将尾巴固定在用于尾静脉注射的专用仪器中，并在定位清晰的尾静脉后，在黄光下使用脉冲夹固定尾静脉。用酒精拭子对尾静脉进行消毒，一旦观察到针尖的血液回流，表明成功进入尾静脉，就释放脉冲夹。在整个治疗期间，每两周评估一次小鼠体重（bw）和空腹血糖（fbg）。治疗结束之后，对所有小鼠实施安乐死，并解剖小鼠获得肾脏组织进行单细胞测序分析。
6、与现有技术相比，本专利技术的优点在于：
7、葡萄糖水平升高不仅会影响肾组织，还会显着改变肾脏的细胞组成。在高血糖条件下，免疫系统易发生功能障碍，导致胰岛素抵抗，引发氧化应激，并促进炎症因子的释放。作为免疫系统的关键调节剂，巨噬细胞可以在高糖环境中激活血管内皮细胞，诱导细胞粘附分子和趋化因子的上调。这导致巨噬细胞分泌多种炎症因子，最终导致肾组织损伤。我们的研究利用单细胞测序以及体外和体内实验，验证了hucmsc-exo可以诱导巨噬细胞活化为m2表型，从而阻碍dkd的进展。
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1.一种人脐带间充质干细胞来源的外泌体作为糖尿病肾病治疗药物的应用。
2.权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备如下步骤：
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，酶消化法是用0.1%胶原酶和0.25%胰酶消化。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，以1.0 x 106接种到25cm培养瓶。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，接种到25cm培养瓶,37℃、5% CO2、饱和湿度条件下细胞培养箱中培养1周左右更换培养液。
6.权利要求2所述的应用，其特征在于，1:2 传代以后随细胞扩增均于80%左右汇合时按1:2持续体外传代培养。
7.权利要求2所述的应用，其特征在于，收集细胞培养上清，在1500 g离心5分钟以消除细胞碎片后，上清液在4°C继续以100000 g离心1小时以分离最终的外泌体。
8.权利要求1-7任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的给药方式为注射。
【技术特征摘要】
1.一种人脐带间充质干细胞来源的外泌体作为糖尿病肾病治疗药物的应用。
2.权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备如下步骤：
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，酶消化法是用0.1%胶原酶和0.25%胰酶消化。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，以1.0 x 106接种到25cm培养瓶。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，接种到25cm培养瓶,37℃...
【专利技术属性】
技术研发人员：张子腾，何宝玉，张斌，马爱玲，别庆丽，张涛，魏海翔，
申请(专利权)人：青海红十字医院，
类型：发明
国别省市：
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