本发明专利技术公开了一种人肝癌细胞中ｓＥＨ基因启动子区甲基化作用的调控元件，涉及基因的转录调控领域。通过将其启动子ＳＰ１不同结合位点序列和部分ＳＰ１结合位点突变的嵌套缺失质粒插入荧光素酶报告基因上游构建一系列真核表达质粒，转染人肝癌细胞瞬时表达，确定了人ｓＥＨ基因启动子在肝癌细胞中在甲基化作用下ＳＰ１关键作用位点对ｓＥＨ基因的转录活性影响。本发明专利技术将有助于从分子水平上探讨包括肝癌在内的肿瘤发病机制，并为研究ｓＥＨ基因在肿瘤细胞中的转录调控机制，以及以ｓＥＨ为靶点的肿瘤预防和治疗开辟新的研究方向提供了参考。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因的转录调控，具体的说，对人肝癌细胞中^^H基因启动子区受转录因子SP1作用的调控元件以及甲基化对此转录调控的影响。
技术介绍
可溶性环氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase, sEH)最早于1W3年由Gill等在研究类似昆虫保幼激素萜类环氧化物的代谢时发现，因其主要位于细胞的可溶性成分如细胞质和过氧化物酶体中而命名。人类s五/f已经被克隆并表达，它是由两个62KD单体构成的同型二聚体，每个单体由富含脯氨酸的肽片段连接。两个区域均具催化活性C末端区域含有典型的a / e水解酶折叠结构，具有环氧化物水解酶的活性。N末端区域具有脂质磷酸酶活性，但其具体生物学作用尚不清楚。W在哺乳动物组织中广泛存在，在肝脏、肾脏、肠和血管中活性较高。在花生四烯酸的代谢通路中，细胞色素P450 2J2和2J9是将花生四烯酸转化为环氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids， EETs)的主要亚型。而EETs在细胞内半衰期较短，主要经s五/Z迅速催化降解为相应的生物活性较弱的物质，且其转化具有区域选择性。在许多组织中它与细胞色素P450 2J2和2J9共同集中分布，三者对维持不同组织中EETs的水平具有重要作用。研究认为很多内源或外源性的环氧化物被认为是潜在的致癌物或者致突变物，并认为与肿瘤的发生发展有着密切的关系。最近的研究发现CYP2J2， 2J9在多种恶性实体肿瘤，如食管癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、肠癌和小细胞肺癌等的表达较癌旁组织和正常组织均有明显升高，进一步发现P450 2J2， 2J9和EETs广泛参与肿瘤增殖的调控作用，并能促进肿瘤细胞的转移。而^五i/作为EETs的高效水解酶，可显著抑制其在肿瘤细胞中的表达及其致瘤作用。的表达模式与CYP 2J2和2J9相反，在恶性肝实体肿瘤组织中表达水平明显低于在癌旁正常组织。推测可能由于^￡ /在肝癌组织中的减少致使CYP 2J2， 2J9及其EETs表达水平升高进而致癌，所以s五/Z很可能作为肝癌变中的重要抑制因子，阻止肿瘤的发生。研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而调控基因表达。DNA的异常甲基化是肿瘤中最常见的分子改变形式之一，己成为探讨肿瘤发生机制新的研究热点。DNA甲基化多发生在CG含量较高的区域(CpG岛)，而此类区域正是转录因子SP1与基因组DNA结合位点。发生甲基化后DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶在甲基转移酶的催化下被选择性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶，会阻滞SP1与其相应的DNA结合位点的相互作用，进而抑制基因的转录表达。肝细胞癌是一种基因启动子CpG岛区域发生高频率甲基化异常的肿瘤，包括基因组总体甲基化水平降低与某些基因(特别是抑癌基因)启动区域发生的高甲基化。大量实验表明，在肝癌发生过程中存在着多种抑癌基因，如P16,P15,P53，Rbl等基因的启动子区CpG岛的高甲基化现象，干扰抑癌基因的转录，导致细胞异常增殖进而引起细胞癌变。研究表明人A//5，侧翼区域富含CG 二联核苷酸，且有一系列SP1结合位点，在人肝癌细胞中，s五/Z表达的降低是否通过甲基化作用来影响转录因子SP1与其DNA结合位点的相互作用有关尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种s五/Z基因启动子区受转录因子SP1调控的元件，通过结合该调控元件来抑制高效水解酶EETs在肿瘤细胞中的增殖作用，阻滞肿瘤细胞的转移。本专利技术的另一个目的在于提供含有上述基因启动子的载体。本专利技术的进一步目的在于提供含有上述载体的宿主细胞。为了实现上述目的，本专利技术利用分子生物学在线软件http://www.uscnorris.com/cpgislands2/cpg.aspx对肝癌细胞s五//基因转录起始位点前后可能存在的转录调控区域(-2000bp +1000bp)进行了分析，发现M/f 5，侧翼区域(-367bp到+602bp)富含CG二联核苷酸，平均在65%以上，认为存在CpG岛，可能存在甲基化作用的修饰，从中找出甲基化对s五/Z基因启动子关键作用位点，对肝癌细胞中s五/f基因的转录表达调控机制有着重要意义。本专利技术中含有人肝癌细胞中s五/Z基因启动子的CpG岛序列，命名为^&Zf0.367，其长度为970bp。核苷酸序列如SEQIDNo.l所示，保留了W/Z5，侧翼区域-367 +602bp，的片段，在SEQIDNo.l中+1为转录起始位点，按顺序往下游为+2......，往上游依次为-1......研究表明，在人肾上皮细胞系293T中，Wi/5，侧翼区域存在三个SP1结合位点。为探讨人肝癌细胞系Hepe G2细胞中人^EF5，侧翼区域可能存在的SP1结合位点以及与甲基化作用的关系，须在甲基化和非甲基化状态下对5'侧翼区域进行缺失分析。为此采用美国加州大学Davis分校Bruce D. Hammock实验室已构建好的一系列启动子区不同SPl结合位点的嵌套缺失质粒以及本专利技术构建的SPl突变质粒(SPl结合位点的中间三个碱基分别进行C-A,G-A碱基突变后的重组质粒)。以甲基转移酶抑制剂5-氮-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理组为非甲基化组，无任何药物处理的对照组，利用萤火虫荧光素酶报告基因分析，比较实验组和对照组之间荧光素酶活性的差异，来探讨转录因子SPl对启动子区的转录调控机制。为减少细胞微环境所造成的误差，以e-gal质粒作为内对照，与上述嵌套缺失质粒同时共转染Hepe G2细胞，用酶标仪测定其光密度以调整因转染效率所带来的差异，每次实验重复三次。分析表明人肝癌细胞系中，s五/Z5'侧翼区域存在5个SPl结合位点，SPlNo.l: GGGCGG (國62bp ~ -57bp); SPl No.2: GGGCGG (-95bp -90bp); SPl No.3:CCCGGCC (-127bp ~ -121bp); SPl No.4: CCCCGCC (-194bp -188 bp); SPl No,5:GGCCCGGGCC (-325bp ~ -316bp)。本专利技术进一步对上述5个SPl结合位点突变重组质粒的荧光素酶活性，以及加入5-氮-2-脱氧胞苷剌激后荧光素酶活性升高的倍数，分析上述5个SP1结合位点对^EH基因转录活性变化。结果显示SP1No.l、 SPlNo.2、 SPlNo.3、 SPl No.4禾卩SPl No.5均可调控s五/Z基因转录活性。其中spiNo.i未被甲基化修饰，可明显增加://基因转录活性，去甲基化作用对s五/Z的转录活性影响不大；SPlNo,2和SPlNo.4存在严格的甲基化牆饰，阻滞SP1与其相互结合进而抑制s五F的转录调控，去甲基化作用能显著增加的转录；SPlNo.3和SPlNo.5存在部分甲基化修饰，对^￡//的转录调控有一定的促进作用，去甲基化作用能更一步增加s五7/的转录。与现有的技术相比，本专利技术的有益效果在于本专利技术首次利用启动子序列不同SP1结合位点的嵌套缺失质粒，并成功构建^E/Z启动子区不同的SP1突变嵌套缺失质粒，转染哺乳动物细胞瞬时表达。确定了在人肝癌细胞中，5￡//基因启动子区特定转录因子SP1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人肝癌细胞中ｓＥＨ基因启动子区的ＣｐＧ岛，其核苷酸序列如下：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种人肝癌细胞中sEH基因启动子区的CpG岛，其核苷酸序列如下SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列。2. 如权利要求1所示的人肝癌细胞中^￡//基因启动子区的CpG岛，其特征在于 含有5个SP1调控元件SP1 No.l: GGGCGG (-62bp -57bp); SP1 No.2: GGGCGG (画95bp -90bp); SP1 No.3: CCCGGCC(-127bp ~ -121bp); SP1 No.4: CCCCGCC (-194bp 陽188bp); SP1 No.5: GGCCCGGGCC (-325bp ~画316bp)。3. 如权利要求2所示...
【专利技术属性】
技术研发人员：张东红，朱毅，
申请(专利权)人：张东红，朱毅，
类型：发明
国别省市：44[中国|广东]
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