本发明专利技术涉及病毒学和生物药学领域。具体而言，本发明专利技术提供了缺陷型水痘病毒株、含有该毒株的疫苗及其应用，为水痘－带状疱疹病毒的治疗和预防提供良好的候选疫苗药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病毒学和生物药学领域。具体而言，本专利技术提供了缺陷型水痘病毒株、 含有该毒株的疫苗及其应用，为水痘-带状疱疹病毒的治疗和预防提供良好的候选疫苗药 物
技术介绍
水痘-带状疱疹病毒(Varicella zoster virus :VZV，简称“水痘病毒”或“VZV”) 是严格种属特异性的病毒，是导致人患水痘或带状疱疹的致病因子。美国专利3985615中 公开了 P-Oka株通过豚鼠胚胎组织(GPEC)多次传代，产生减毒的V-Oka病毒，制备预防水 痘的V-Oka活疫苗。美国专利4000256中叙述了用人胚成纤维细胞WI-38株传代培养VZV病 毒10-80次生产VZV减毒疫苗。迄今为止，只有P-Oka株经细胞传代获得的“水痘病毒减毒 冈株”(特公昭53-41202号公报)；Lancet 2 1288-1290,1974)为WHO批准的唯一用于预防 水痘或带状疱疹疫苗制备的毒株，该毒株制备的疫苗在全球得到了广泛使用[Requirement for Varicella Vaccine (Live)Adopted 1984 :WH0Technical Report Series, No. 725, pp.102-104，1985]。水痘病毒减毒R株鉴定的专利CN1163604C，从分子水平上揭示该毒株是由多个不 同序列组成的混合株。野毒株可能存在于其中，源于V-Oka疫苗接种者产生V-Oka株的带 状疱疹已有报道。故该减毒株的潜在危害性还是存在的，但是，现在还没有其它抗VZV的疫 苗株上市。该病毒具有严格种属特异性，人是其唯一的自然宿主，病毒基因的功能研究难度 较大；再者该病毒对细胞具有强烈的依赖性，获得可用于转化的VZV病毒DNA非常困难，故 该病毒的研究进展较为缓慢。随着分子遗传学研究的飞速发展，基因操作手段的不断革新，基因插入或删除成 为发现新基因或研究基因功能的重要手段，突破了 VZV基因研究的瓶颈。1993年Jeffrey I.等在 “Generation of varicella-zoster virus (VZV) and viral mutants from cosmid DNA s :VZV thymidylate synthetase is not essential for replication invitro，， 一文中通过科斯质粒(Cosmid)实现对腺苷合成酶基因的操作，揭示将终止密码子引入腺 苷合成酶基因导致该酶不表达，但不影响病毒生长速率和对阿昔洛韦的敏感性。这项研 究开创了体外VZV基因操作方法，为基因功能研究奠定了基础。2000年George W等在 “OpenReading Frame S/L of Varicella-Zoster Virus Encodes aCytoplasmic Protein Expressed in Infected Cells” 一文中描述了通过基因部分结构删除的方法发现了 VZV 新基因，即ORF S/L。随着细菌人工染色体(BAC)在研究中的应用，组织培养技术的进 步，异种生物间器官移植屏障的突破(联合免疫缺陷型小鼠的开发)，拓宽了种属特异 的VZV基因功能研究的空间，可以在体外或动物体内进行VZV基因功能研究。2004年 Kazuhiro N.等在Cloning of thevarieel la-zoster virus genome as aninfectious bacterialartif icial chromosome in Escherichia coli，，一文中揭不被克隆到 BAC 载体 上的VZV Oka株全基因组，可以在大肠杆菌和人胚肺细胞中增殖，BAC可被一同转化到人胚肺细胞中的Cre酶精确切除，产生的重组VZV病毒具有ρ-Oka同样结构，完全具有亲本病毒的特性。BAC的应用为VZV的功能研究带来了极大便利，加速了 VZV基因功能研究进程。 2007年Zhang Ζ.等利用BAC载体和基因同源重组技术揭示多个基因的体内外功能。
技术实现思路
本申请人以含P-Oka全基因组的BAC(VZV-BAC)为基础，通过基因重组手段，获得 0RF7缺失的病毒株VZV-7D，保藏号为CGMCC3207，保藏日期为2009年7月28日，保藏单位 名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址为北京市 朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所(邮编100101)，该保藏的病毒株VZV-7D的分类命 名为水痘病毒。体内外证实该病毒株不感染皮肤和感觉神经节，故不存在再活化产生带状 疱疹的潜在危害；该毒株可在MRC-5、Mewo细胞上生长，且同P-Oka株生长一致；该毒株保 留了 P-Oka株的所有糖蛋白，其免疫原性理应同P-Oka株的免疫力相同；该毒株是通过Karf 筛选到的单一克隆株，不存于混合型V-Oka株的潜在危害；由于整个0RF7删除，VZV-7D株 不可能产生回复突变，因而，以VZV-7D株制备减毒活疫苗更为安全和有效。而且，VZV-7D至 少可以克隆IOkb的外源基因而不影响其本身生长和增殖，故可以用作外源基因表达载体， 制备用于诊断、预防和治疗的生物制品。申请人:如下进行了 P-Oka株0RF7缺失株(VZV-7D)的制备。因为水痘-带状疱疹 病毒(VZV)的0RF7位于病毒基因组的8607-9386bp之间，编码一个29kDa的蛋白，可能位 于皮层结构中，它的功能仍不清楚。VZV 0RF7蛋白与单纯疱疹病毒(HSV)中的UL51为同源 蛋白。HSV UL51基因编码一个磷酸化蛋白，分子量约为27，29和30kDa，在感染后期表达， 与病毒出细胞体有关(Daikoku，Ikenoya et al，1998)。一项研究报告指出HSV UL51蛋白 定位于感染细胞的高尔基体标志蛋白上，UL51蛋白通过N-端第9位的半胱氨酸铆钉到高 尔基体上(Nozawa，Daikoku，et al，2003)。UL-51无效突变揭示其在HSV复制循环中的作 用。最近的研究显示突变株病斑较小，最大滴度比野生株降了 100倍。电子显微镜显示核 衣壳的形成不受UL51删除影响，但是，病毒出核周质腔受到严重影响，这现象揭示UL51蛋 白涉及到HSV病毒颗粒的成熟和出核(Nozawa，Kawaguchi et al. 2005)。通过伪狂犬病毒 (PrV)UL51缺失突变揭示此基因表达产物也具有相似的功能。一步生长曲线揭示PrV-De It aUL51F不仅滴度稍有下降，而且病斑减小明显，只有野生株大小的30%。细胞质内的衣壳 大量存在，病毒无包被或处于包被不同阶段，所以，研究结果推断UL51蛋白参与病毒的外 出，对病毒复制不是必需的(Klupp，Granzow et al. 2005)。本专利技术以来自斯坦福大学医学院Dr. Ann Arvin实验室的P-Oka临床分离株为材 料，以VZV-BAC(P-Oka)为框架，应用细菌同源重组原理产生重组克隆。全长0RF7被Kanlr基 因取代而产生7D-VZVBAC。7D-VZVBAC与含Cre酶的重组质粒一同电转MRC-5细胞，产生无 0RF7的水痘病毒(VZ本文档来自技高网...
【技术保护点】
水痘病毒ＯＲＦ７全部或部分缺失、插入终止密码子、碱基取代等结构改变引起的功能丧失。
【技术特征摘要】
水痘病毒ORF7全部或部分缺失、插入终止密码子、碱基取代等结构改变引起的功能丧失。2.水痘缺陷性病毒7D研制方法a)通过BAC手段克隆水痘病毒DNA全序列，在通过细菌内重组获得0RF7缺失的水痘缺 陷型病毒(7D-BAC)；b)通过Cre酶的作用在Mewo细胞或MRC-5细胞中删除BAC，产生用于疫苗生产的 VZV-7D 株；c)在水痘病毒0RF-7缺失基础上的联合缺失突变的水痘缺陷性病毒。3.根据权利要求1所述的水痘缺陷型病毒7D制备的活疫苗a)预防水痘的7D活疫苗，b)预防带状疱疹的7D活疫苗。4.根据权利要求2所述的VZV-7D培养的细胞株包括a)Mewo细胞、MRC-5细胞、2BS细胞、WI-38细胞和...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱桦，李益民，叶祥忠，程通，张雅丽，
申请(专利权)人：新泽西医学院，北京万泰生物药业股份有限公司，厦门大学，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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