一种用于表皮黑素细胞体外培养的培养基制造技术

本发明专利技术提供了一种用于表皮黑素细胞体外培养的培养基，所述培养基以适用于表皮黑素细胞体外培养的基础培养基为基质，并添加：（１）生长因子、（２）ｃＡＭＰ促进剂和（３）血清。本发明专利技术的有益效果主要体现在：本发明专利技术提供了专门用于表皮黑素细胞的体外培养的培养基，可用于培养增殖能力、迁移能力和黑素合成能力强的表皮黑素细胞，可以使患者的黑素细胞在体外更好的生长及分化，可用于移植治疗色素减退或无色素性皮肤病患者。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于表皮黑素细胞体外培养的培养基。(二)
技术介绍
皮肤颜色主要由皮肤制造的色素和皮肤表层所含天然色素的组合所决定。皮肤上 皮层表面的表皮中含有能制造皮肤色素(即黑色素)的表皮黑素细胞。色素减退或无色素 性皮肤病患者的皮肤黑素细胞缺失、被破坏或无功能，从而在身体各部位出现白斑。 黑色素不但具有保护作用，在皮肤美学上也至关重要。某些疾病可引起局部黑素 细胞破坏、缺失或细胞功能受抑制，影响皮肤色素制造系统，从而导致皮肤色素减退或者色 素缺失。此种异常会造成患者心理学和社会学的严重损害。 白癜风是一种特殊的皮肤色素性疾病，以出现白斑和表皮黑素细胞缺失为主要特 征。当前治疗包括光敏剂(如补骨脂素)联合UVA照射、窄波UVB照射或者局部使用(肾 上腺)皮质类固醇，但疗效低，并伴随一定副作用(Shaffali and Gawkrodger， 2000， Clin Exp Dermatol 25 :575)。 外科移植技术已经应用于白癜风治疗，如负压吸疱移植、刃厚皮片移植或微小皮 片移植(Koga et al. ，1988，Arch Dermatol 124 :1656 ;Gupta etal. ， 1999， Dermatol Surg 25 :955 ;Falabella， 1984， J Dermatol Surg OncollO :136 ;Suva即rakorn et al. ， 1985， J Am Acad Derm 13 :968 ;Sarkar et al. ，2001，J Dermatol 28 :540 ;Pai et al. ，2002，J. Eur Acad Dermatol Venereo116 :604)。这些治疗在局限性和小面积病损的患者中有效。但对 白斑面积大或者白斑数量多的患者，获得足够的移植皮片具有一定困难(Van Geel， N. et al. ，2001， Dermatology 202 :162)。 要成功地进行大面积的自体表皮移植，需有大的移植皮片，内含大量细胞，特别是 黑素细胞。或者，可通过细胞培养大量扩增自体黑素细胞用于移植。这种方法需要从病人健 康皮肤取得黑素细胞，在体外将其培养在合适环境中(可促进细胞增殖、迁移和黑素制造) 使之大量扩增，再在合适条件下将细胞移植至病人病变处皮肤，使之恢复正常颜色。 Lerner等(1987， J Invest Derm 89 :219)介绍了黑素细胞移植治疗斑驳病(一 种遗传疾病，以先天性缺乏黑色素细胞导致皮肤白斑和白发为特点)。通过皮切活检术获 得一小块皮肤，用含有TPA(12-0-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate)，异甲基黄嘌呤 (3-isobutyl-l-methylxanthine， IBMX)，霍乱毒素及新生牛血清的培养基培养表皮黑素细 胞。虽然细胞成功地移植到了色素减退区域，但由于培养基中含有TPA(—种肿瘤促进因 子)，使这种培养基不适合用于人类移植。 U. S. Pat. No. 4， 757， 019介绍了一种人黑素细胞培养基的使用。此培养基包括MEM 基础培养基，5%胎牛血清，phorbol 12-myristatel3-acetate (PMA，即TPA， 10ng/ml)和霍 乱毒素(10—8M)。由于这种培养基含有TPA，也不适合用于人类移植。 Olsson等(1992， Lancet 340 :981)报告的表皮黑色素细胞培养基配方，包含 PC-1，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，丁酰环腺苷酸(dbcAMP)，青霉素-链霉素。该培养基用于在自体黑素细胞移植中扩增分离到的表皮黑色素细胞。此培养基不包含促进黑色素 细胞生长和分化必需的血清。此外，bFGF的浓度(5ng/ml)太低，不能剌激表皮黑色素细胞 作足够的生长。而dbcAMP不是一种天然物质，作用时间也很短。另外，对所培养细胞的数量 和黑素含量均无量化指标报道，因此，很难评价这一培养基的效率。值得注意的是，Olsson 等后来己使用非培养的表皮黑色素细胞移植治疗白癜风(Olsson and Juhlin， 1998， Br J Dermatol 138 :644)。 另外的培养基，如HU16(FIC培养基)已被我们用于培养表皮黑素细胞。HU16 培养基包括F12培养基(一种商品化的基础培养基)，补充有效浓度的bFGF、 IBMX，霍乱 毒素和胎牛血清。该培养基已经在台湾成功应用于120例白癜风患者黑素细胞移植治 疗中的黑素细胞培养(Chen etal. ， 1999， Show Chwan Med J 1 :85 ;Chen et al.，2000， J.Dermatol 27 :434 ;Chen et al. ;2001)。另一种表皮黑素细胞培养基(HU74)，含有bFGF、 肝细胞生长因子(HGF)、肾上腺素和a-MSH，已经建立并在美国成功申报专利(US Patents 6943024and 7132279)。 虽然培养表皮黑素细胞的培养基很多，但都不是最佳的。因此，一些患者因为细胞 生长不佳，必须长时间等待；另一小部分患者细胞生长差，达不到移植需要。另外， 一些移植 成功的病人在移植区域的边缘缺乏色素形成，这可能与培养基不能有效剌激细胞的迁移有 关(Chen et al. 1999， Show Chwan Med J 19991 :85 ;Chen et al. ，2000， J.Dermatol 27 : 434)。 因此，建立一种在体外培养表皮黑素细胞的新培养基是必要的，该培养基应是由 非毒性和/或天然和/或生理学谐调的物质组成，能促进表皮黑素细胞增殖，并能表达正常 表皮黑素细胞特性，(黑素合成和细胞迁移).最近发现有些生长因子能剌激不同种类细胞 的生长。其中，成纤维细胞生长因子20(FGF20)是一种属于FGF家族的多功能生长因子，最 早发现于2001年。FGF20与各种器官、组织和细胞的发育、生长和分化有关。FGF20可剌激 不同细胞的生长和存活，特别是保护细胞对抗辐射和氧化应激的损伤。FGF20被研究用于 减轻癌症化疗后的口腔粘膜炎，其作用在I期临床中获得肯定，且耐受良好(Schuster et al. ，2008， Support CareCancer 16 :477 ;Maclachlan et al. ，2005， Int J Radiat Biol 81 :567 ;Lavine Etal. ，2005，Dev Cell 8 :85 ;Ohmachi et al. ，2003，J Neurosci Res 72 : 436) 。 FGF20在表皮黑素细胞生长和黑素合成上的作用尚未见报道。 间羟异丙肾上腺素(Met即roterenol)是一种选择性的P 2肾上腺素能的激动剂。 间羟异丙肾上腺素通过cAMP第二信使系统激活13 2肾上腺素能的受体，从而剌激黑素细 胞生长与黑素合成。13 2肾上腺素能的激动剂可剌激眼黑素细胞的生长和黑素合成；a -， 13 1和-13 3-肾上腺素能的激动剂对生长和黑素合成没有作用(Hu et al. ，2000， E本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于表皮黑素细胞体外培养的培养基，所述培养基以适用于表皮黑素细胞体外培养的基础培养基为基质，所述基质中添加有：（１）体积浓度５％～３０％的血清、（２）３～１０００ｎｇ／ｍＬ的生长因子和（３）ｃＡＭＰ促进剂；所述生长因子为下列之一或其中两种以上的混合：ＦＧＦ２０、ｂＦＧＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、转录生长因子β；所述ｃＡＭＰ促进剂为下列之一或其中两种以上的混合：１～１０００μｇ／ｍＬ的异甲基黄嘌呤、１～１０００μＭ的间羟异丙肾上腺素、１～１０００μＭ的Ｌ－肾上腺素。

【技术特征摘要】
一种用于表皮黑素细胞体外培养的培养基，所述培养基以适用于表皮黑素细胞体外培养的基础培养基为基质，所述基质中添加有(1)体积浓度5％～30％的血清、(2)3～1000ng/mL的生长因子和(3)cAMP促进剂；所述生长因子为下列之一或其中两种以上的混合FGF20、bFGF、HGF、EGF、转录生长因子β；所述cAMP促进剂为下列之一或其中两种以上的混合1～1000μg/mL的异甲基黄嘌呤、1～1000μM的间羟异丙肾上腺素、1～1000μM的L-肾上腺素。2. 如权利要求l所述的培养基，其特征在于所述基础培养基为下列之一Ham' s F12 培养基、RPMI培养基、DMEM培养基。3. 如权利要求1所述的培养基，其特征在于所述基质中添加有下列组分(1) 体积浓度10 % 20%的血清；(2) 1 100ng/mL的bFGF和10 300ng/mL的FGF20 ;(3) 3 300 ii g/mL的异甲基黄嘌呤和3 100 y M的间羟异丙肾上腺素...

【专利技术属性】
技术研发人员：许爱娥，胡诞宁，傅丽芳，周妙妮，尉晓冬，洪为松，关翠萍，
申请(专利权)人：许爱娥，胡诞宁，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]