【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及女性抑郁症研究，具体涉及一种验证prl作为女性抑郁症外周标志物的方法。
技术介绍
1、随着时代的快速发展，人们承受的生活、工作、学习等的压力也随之在增加，抑郁症是一种复杂的异质性大脑疾病，其基础是一系列生化、分子遗传学和解剖学的改变。现有的数据认为情感病理与大脑单胺系统功能障碍、下丘脑-垂体-肾上腺（hpa）系统损伤、大脑营养因子的产生降低和扭曲的神经可塑性有关，并与参与中枢神经系统（cns）功能的几个基因的多态性和表观遗传修饰相关。尽管积累了大量的数据来了解抑郁症发生、发展和病程，但是目前对抑郁症的诊疗仍然有很多不足之处。精神神经疾病具有其独特的复杂性，多年来都希望找到一个客观可靠的生物学指标帮助诊断抑郁症，但是由于精神障碍疾病的特殊性，在抑郁症及其他精神障碍疾病的诊断过程中，目前仍是主要依靠病史、症状学表现、量表进行评价。近年来，辅助精神障碍诊断的多项新技术开始出现并迅速发展，如功能性近红外光谱成像、眼动仪及脑涨落技术。目前我国精神专科检查、诊断手段任然有很多不足，尤其是特异性的辅助检查手段亟待丰富和完善。
2、催乳素又称“泌乳素，prl”，是人体下丘脑垂体所分泌的一种激素，prl的分泌受下丘脑催乳素释放因子（prf）与催乳素释放抑制因子(pif)的双重调控，通过下丘脑-垂体门静脉循环传递。在大多数情况下，pif占优势，主要由多巴胺介导抑制prl的释放。prf由下丘脑促甲状腺激素释放激素介导促进prl的释放，其他prf有促性腺激素释放激素（gnrh）、血清素、鸦片肽μ受体等。prf和pif之间的平衡
3、prl和多巴胺又有一定的对抗作用，prl的升高就会使机体的多巴胺分泌减少，从而使人常感到抑郁。就像在哺乳期，经常会发生产后抑郁，其中一个原因就是由于prl分泌增高而抑制了多巴胺的分泌。
4、经研究发现prl与女性抑郁症存在一定相关性，能够辅助诊断抑郁症，成为一种新型外周血标志物，因此，本专利技术提供一种实验方法对其进行验证。
技术实现思路
1、为了克服上述技术问题，本专利技术提供一种验证prl作为女性抑郁症外周标志物的方法，具体方案如下：
2、一种验证prl作为女性抑郁症外周标志物的方法，其特征在于包括以下步骤：
3、步骤1：收集符合icd-10诊断标准的18例成人女性抑郁症患者外周血样本作为抑郁组，另外收集19例健康成人女性外周血样本作为对照组，所有受检者均经8~12小时禁食，于次日清晨6:00~7:00空腹状态抽取肘静脉血5ml，待充分凝固后，3500r/min，离心5分钟，分离血浆，采用elisa方法检测各组外周血血浆prl的表达水平；
4、步骤2：准备30只spf一级6-8周龄的c57bl/6j雌性小鼠，将这些小鼠在实验新环境中适应一周，避免小鼠在新环境中因出现不良情绪对实验结果造成影响；
5、步骤3：制备lps（脂多糖）抑郁模型小鼠，将步骤2中30只小鼠分为两组，其中17只小鼠按照2mg/kg/天的剂量进行腹腔注射lps ，持续3天，作为实验组；另外13只小鼠注射同等体积的生理盐水作为对照组；
6、步骤4：步骤3完成后，通过对两组小鼠进行旷场实验、悬尾实验评估实验组小鼠是否出现抑郁样行为，进而判断是否造模成功；
7、步骤5：采用elisa方法对步骤4中两组小鼠外周血中prl水平进行检测。
8、基于上述，步骤4中旷场实验是对小鼠进行焦虑抑郁样行为检测，实验前一天将小鼠放置在旷场实验的房间内进行环境适应，实验时将小鼠单独放置在一个正方形旷场中心，用电脑设置行为学分析记录软件smart 3.0，记录适应5秒后小鼠5分钟内的行为学；每一只小鼠实验结束后，需用75%酒精彻底清扫旷场以消除气味的影响，之后进行下一只小鼠的实验；实验结束后统计每只小鼠的总移动距离、中心区滞留时间百分比，通过总移动距离与中心区滞留时间百分比评估小鼠在新环境中的自发活动、探索能力及焦虑状态；当小鼠处于抑郁状态时，自发活动减少，表现为移动总距离的减少；而中心区域滞留时间百分比可以用来评价小鼠的焦虑样行为，小鼠焦虑时进入中心区域的时间会有所降低。
9、基于上述，步骤4悬尾实验中通过统计小鼠的不动时间评估其抑郁绝望状态，实验时需将小鼠的尾部距尾尖1-2cm处黏贴在盒子顶部，小鼠的头部向下距离盒子底部20-25cm，当悬吊的小鼠没有明显挣扎时，认为其是不动的，实验持续5 min，统计实验过程中小鼠的累计不动时间，每次操作1只小鼠，小鼠焦虑时累计不动时间会有所增加。
10、基于上述，步骤5包括以下操作步骤：
11、（1）标本采集：采用眼眶静脉采血法，分别抽取各组小鼠眼眶血于edta抗凝管中，3500r/min，离心5分钟，分离血浆备用；
12、（2）elisa具体操作步骤：
13、（a）实验开始前，先将所有试剂平衡至室温30min；
14、（b）向冻干标准品中加入1ml的标准品和样本稀释液，静置10min，随后震荡离心混匀，然后按试剂盒所给出的浓度梯度将其依次稀释为对应浓度的标准品；
15、（c）向酶标板中加入100μl相应浓度的标准品或待测样本，注意不要产生气泡，尽量不触及孔壁，随后在酶标板上加盖覆膜，置于震荡器上37℃恒温孵育80min；
16、（d）使用双蒸水将25×浓缩洗涤液稀释25倍，孵育结束后倒掉酶标板中的液体，每孔加入200μl稀释后的洗涤液并浸泡1分钟，随后倒掉洗涤液，并在吸水纸上拍干，共重复三次；
17、（e）提前15分钟使用生物素化抗体稀释液将浓缩生物素化抗体稀释100倍，并震荡混匀，洗板完成后每孔加入100μl稀释后的生物素化抗体，加样顺序为标准品和待测样品加入的顺序，并在酶标板上加盖覆膜，随后置于震荡器上37℃恒温孵育50min；
18、（f）孵育结束后倒掉酶标板中的液体，每孔加入200μl稀释后的洗涤液并浸泡1分钟，随后倒掉洗涤液，并在吸水纸上拍干，共重复三次；
19、（g）提前15分钟使用酶结合物稀释液将浓缩hrp酶结合物稀释100倍，并震荡混匀，洗板完成后每孔加入100μl稀释后的hrp酶结合物，加样顺序需与生物素化抗体相同，随后置于震荡器上37℃恒温孵育50min；
20、（h）孵育结束后倒掉酶标板中的液体，每孔加入200μl稀释后的洗涤液并浸泡1分钟，随后倒掉洗涤液，并在吸水纸上拍干，共重复五次；
21、（i）每孔加入90μl的tmb显色底物溶液，加样顺序需与hrp酶结合物相同，随后置于震荡器上37℃恒温孵育10min；
22、（j）每孔加入50μl的终止液，加样顺序本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种验证PRL作为女性抑郁症外周标志物的方法，其特征在于包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的验证PRL作为女性抑郁症外周标志物的方法，其特征在于：步骤4中旷场实验是对小鼠进行焦虑抑郁样行为检测，实验前一天将小鼠放置在旷场实验的房间内进行环境适应，实验时将小鼠单独放置在一个正方形旷场中心，用电脑设置行为学分析记录软件Smart 3.0，记录适应5秒后小鼠5分钟内的行为学；每一只小鼠实验结束后，需用75%酒精彻底清扫旷场以消除气味的影响，之后进行下一只小鼠的实验；实验结束后统计每只小鼠的总移动距离、中心区滞留时间百分比，通过总移动距离与中心区滞留时间百分比评估小鼠在新环境中的自发活动、探索能力及焦虑状态；当小鼠处于抑郁状态时，自发活动减少，表现为移动总距离的减少；而中心区域滞留时间百分比可以用来评价小鼠的焦虑样行为，小鼠焦虑时进入中心区域的时间会有所降低。
3.根据权利要求1所述的验证PRL作为女性抑郁症外周标志物的方法，其特征在于：步骤4悬尾实验中通过统计小鼠的不动时间评估其抑郁绝望状态，实验时需将小鼠的尾部距尾尖1-2cm处黏贴在盒子顶部，小鼠的头
4.根据权利要求1所述的验证PRL作为女性抑郁症外周标志物的方法，其特征在于步骤5包括以下操作步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种验证prl作为女性抑郁症外周标志物的方法，其特征在于包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的验证prl作为女性抑郁症外周标志物的方法，其特征在于：步骤4中旷场实验是对小鼠进行焦虑抑郁样行为检测，实验前一天将小鼠放置在旷场实验的房间内进行环境适应，实验时将小鼠单独放置在一个正方形旷场中心，用电脑设置行为学分析记录软件smart 3.0，记录适应5秒后小鼠5分钟内的行为学；每一只小鼠实验结束后，需用75%酒精彻底清扫旷场以消除气味的影响，之后进行下一只小鼠的实验；实验结束后统计每只小鼠的总移动距离、中心区滞留时间百分比，通过总移动距离与中心区滞留时间百分比评估小鼠在新环境中的自发活动、探索能力及焦虑状态；当小鼠处于抑郁状态...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈晨，冯来鹏，李文强，苏玺，刘青，王琪，张露文，杨梦雨，仝李丹，任梦迪，
申请(专利权)人：河南省精神病医院新乡医学院第二附属医院，
类型：发明
国别省市：
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