【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学检测，具体涉及用于外泌体rna检测的内参基因及引物探针和检测试剂盒。
技术介绍
1、exosome，又称为外泌体，直径30～150nm，是一种由细胞内多囊泡体(multivesicular body,mvb)与细胞膜融合后释放到细胞外环境中的脂质双分子膜包裹的小囊泡，外泌体中包含多种核酸(dna、mrna、microrna(mirna)、lncrna、circrna等)和蛋白质。
2、rt-pcr检测过程中，无论是定性还是定量检测，内参对整个检测过程的质控和靶标定量值的确定都十分关键。对于比较完整的核酸片段，更倾向于用管家基因做rt-pcr的内参基因，因为管家基因表达量比较高，且相对恒定，常用的内参基因有gapdh，β-actin，18s rrna等。外泌体由于其核酸片段比较短，不是完整的基因片段，常规的管家基因并不一定是大量被外泌体包裹的，导致在不同样本间的检测结果中，常规的管家基因检测结果差异较大，稳定性比较差。所以，对外泌体核酸进行检测，需要重新对管家基因进行筛选。
3、当前外泌体核酸进行rt-pcr分析常用的内参基因是microrna，由于其结构特殊性，进行逆转录时的策略与常规的mrna逆转录差别比较大，需要特殊的颈环引物，因此采用microrna作内参对整个mrna的逆转录过程是没有质控作用的，也就不能实现对外泌体rna的定性或定量。因此，迫切需求开发适合外泌体rna检测的内参基因。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是，提供
2、本专利技术为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
3、本专利技术提供了hsp70基因作为内参基因在外泌体rna检测中的应用。
4、作为优选实施方案，所述外泌体rna为血浆外泌体rna。
5、作为优选实施方案，所述hsp70内参基因用于外泌体eml4-alk融合基因的检测。
6、作为优选实施方案，所述hsp70内参基因为mrna序列。
7、本专利技术还提供用于检测所述的hsp70内参基因的引物，正向引物序列如seq idno:1所示，反向引物序列如seq id no:2所示。
8、本专利技术还提供用于检测所述的hsp70内参基因的探针，所述探针的序列如seq idno:3所示。
9、作为优选实施方案，用于外泌体eml4-alk融合基因检测的引物序列如seq id no:4和seq id no:5所示，探针序列如seq id no:6所示。
10、本专利技术还提供一种外泌体rna的rt-pcr检测试剂盒，所述试剂盒包括用于检测内参基因hsp70的引物和探针。
11、作为优选实施方案，检测内参基因hsp70的引物序列如seq id no:1和seq id no:2所示，探针序列如seq id no:3所示；所述引物在检测体系中的浓度为100-900nm，探针在检测体系中的浓度为25-500nm。
12、作为优选实施方案，所述试剂盒用于检测eml4-alk融合基因，检测eml4-alk融合基因的引物序列如seq id no:4和seq id no:5所示，探针序列如seq id no:6所示。
13、本专利技术中提供的所有探针5′端均带有荧光基团，荧光基团选自vic、fam、rox或hex；3′端带有淬灭基团，淬灭基团选自mgb或bhq1基团。
14、作为优选实施方案，所述试剂盒还包括反应液a和反应液b，所述反应液a的组成为：1-100mm datp，1-100mm dctp，1-100mm dgtp，1-100mm dutp，1-50mm mgcl2，1-500mmtris-hcl，1-500mm kcl；所述反应液b的组成为：1-5u/μl的逆转录酶，1-5u/μl的rna酶抑制剂，1-5u/μl的热启动dna聚合酶，1-5u/μl的热启动dna聚合酶抗体，0.01-0.1u/μl的热敏的udg酶，质量浓度为1-10％的bsa溶液。
15、进一步优选地，所述反应液a的组成为：1mm datp，1mm dctp，1mm dgtp，2mm dutp，15mm mgcl2，100mm tris-hcl，250mm kcl；所述反应液b的组成为：3-4u/μl的逆转录酶，2-3u/μl的rna酶抑制剂，1-2u/μl的热启动dna聚合酶，1-2u/μl的热启动dna聚合酶抗体，0.06-0.07u/μl的热敏的udg酶，质量浓度为2-3％的bsa溶液。
16、进一步优选地，所述反应液b的组成为：3.33u/μl的逆转录酶，2.67u/μl的rna酶抑制剂，1.67u/μl的热启动dna聚合酶，1.67u/μl的热启动dna聚合酶抗体，0.067u/μl的热敏的udg酶，质量浓度为2.17％的bsa溶液。
17、与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
18、1，本专利技术提供的内参基因hsp70在健康人和癌症病人血浆外泌体中均能稳定地检出，且受采血管种类影响较小，冻存血浆也能检出，因此，可以作为外泌体检测的内参基因。
19、2，本专利技术提供的内参基因hsp70为mrna序列，逆转录无需特殊的颈环引物，可与靶标同管进行逆转录和rt-pcr，能实现从外泌体分离到rt-pcr结束的全流程质控。用于外泌体eml4-alk融合基因检测时，内参基因hsp70可以与靶标检测一起进行逆转录和多重rt-pcr。
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1.HSP70基因作为内参基因在外泌体RNA检测中的应用。
2.根据权利要求1所述的HSP70基因作为内参基因在外泌体RNA检测中的应用，其特征在于：所述外泌体RNA为血浆外泌体RNA。
3.根据权利要求1所述的HSP70基因作为内参基因在外泌体RNA检测中的应用，其特征在于：所述HSP70内参基因用于外泌体EML4-ALK融合基因的检测。
4.根据权利要求1所述的HSP70基因作为内参基因在外泌体RNA检测中的应用，其特征在于：所述HSP70内参基因为mRNA序列。
5.用于检测权利要求1所述的HSP70内参基因的引物，其特征在于：正向引物序列如SEQID NO:1所示，反向引物序列如SEQ ID NO:2所示。
6.用于检测权利要求1所述的HSP70内参基因的探针，其特征在于：所述探针的序列如SEQ ID NO:3所示。
7.根据权利要求3所述的HSP70基因作为内参基因在外泌体RNA检测中的应用，其特征在于：用于外泌体EML4-ALK融合基因检测的引物序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5
8.一种外泌体RNA的RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括用于检测内参基因HSP70的引物和探针。
9.根据权利要求8所述的外泌体RNA的RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：检测内参基因HSP70的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，探针序列如SEQ ID NO:3所示；所述引物在检测体系中的浓度为100-900nM，探针在检测体系中的浓度为25-500nM。
10.根据权利要求8所述的外泌体RNA的RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒用于检测EML4-ALK融合基因，检测EML4-ALK融合基因的引物序列如SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5所示，探针序列如SEQ ID NO:6所示。
11.根据权利要求8所述的外泌体RNA的RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应液A和反应液B，所述反应液A的组成为：1-100mM dATP，1-100mM dCTP，1-100mMdGTP，1-100mM dUTP，1-50mM MgCl2，1-500mM Tris-HCl，1-500mM KCl；所述反应液B的组成为：1-5U/μL的逆转录酶，1-5U/μL的RNA酶抑制剂，1-5U/μL的热启动DNA聚合酶，1-5U/μL的热启动DNA聚合酶抗体，0.01-0.1U/μL的热敏的UDG酶，质量浓度为1-10％的BSA溶液。
...【技术特征摘要】
1.hsp70基因作为内参基因在外泌体rna检测中的应用。
2.根据权利要求1所述的hsp70基因作为内参基因在外泌体rna检测中的应用，其特征在于：所述外泌体rna为血浆外泌体rna。
3.根据权利要求1所述的hsp70基因作为内参基因在外泌体rna检测中的应用，其特征在于：所述hsp70内参基因用于外泌体eml4-alk融合基因的检测。
4.根据权利要求1所述的hsp70基因作为内参基因在外泌体rna检测中的应用，其特征在于：所述hsp70内参基因为mrna序列。
5.用于检测权利要求1所述的hsp70内参基因的引物，其特征在于：正向引物序列如seqid no:1所示，反向引物序列如seq id no:2所示。
6.用于检测权利要求1所述的hsp70内参基因的探针，其特征在于：所述探针的序列如seq id no:3所示。
7.根据权利要求3所述的hsp70基因作为内参基因在外泌体rna检测中的应用，其特征在于：用于外泌体eml4-alk融合基因检测的引物序列如seq id no:4和seq id no:5所示，探针序列如seq id no:6所示。
8.一种外泌体rna的rt-pcr检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括用于检测内参基因hsp7...
【专利技术属性】
技术研发人员：乔春晓，仁青措，蔡静，焦利娟，张亚楠，
申请(专利权)人：上海思路迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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