【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，具体涉及一种质粒dna的分离纯化方法。
技术介绍
1、质粒存在于许多细菌及酵母等生物中，是细胞染色体能够自主复制的很小的环状dna分子。质粒是基因工程中最常用的载体，可以作为疫苗或者治疗性药物单独使用；也可以在病毒生产中作为病毒包装的原料；在mrna疫苗或药物的生产中，可以作为体外转录反应的模板，用于mrna的体外转录制备。随着基因治疗、细胞治疗和mrna药物的快速发展，质粒dna得到了更加广泛的应用。因此，高纯度、高质量的质粒dna的工程大规模生产需求不断增加。
2、质粒dna提取及纯化的工艺流程包括：菌体发酵、菌体裂解、澄清过滤、浓缩、层析纯化。目前市面上制备质粒纯化工艺，使用的还是cytiva提供的传统的质粒纯化三步法方案。首先使用凝胶过滤(6ff)，在高硫酸铵浓度下(2.1m)，利用质粒dna与宿主rna分子量的差别进行分离。该层析的作用是除去宿主rna以及其他杂质，收率为90％左右。优点是回收率高，对大小不同的质粒适用性强。但是缺点也非常明显，凝胶层析为非特异性过滤，样品的上样体积有限，上样体积小于柱体积的1/3，且层析过程中，流速需要控制在30-60cm/h，否则会导致质粒dna与rna分离度变差。故层析时间较长；第二步层析使用的亲和填料(plasmidselect xtra)。该步层析可有效分离超螺旋质粒和开环质粒。收率约70％-80％；第三步层析使用的是强阴离子交换填料(source 30q)，作用是除去内毒素和其他痕量杂质。该层析收率约50-70％，收率较低，且需要通过稀释3
3、因此，需要开发一种快速高效的质粒dna分离纯化方法，在提升质粒产量和品质的同时，降低制备成本。
技术实现思路
1、本专利技术所解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能够快速高效分离纯化质粒dna且成本更低，更适合工业化大规模制备质粒dna的工艺。
2、为解决以上技术问题，本专利技术采用如下技术方案：
3、一种质粒dna的分离纯化方法，所述的分离纯化方法包括以下步骤：
4、(1)含目的质粒的菌体裂解液经过滤得到含目的质粒的菌体裂解上清液；
5、(2)将所述含目的质粒的菌体裂解上清液经膜浓缩后换液得到粗提溶液；
6、(3)将所述粗提溶液依次通过第一层析柱和第二层析柱进行层析分离，得到纯化后的质粒溶液，
7、其中，第一层析柱所采用的填料为具有分子筛功能、离子交换功能和疏水功能的多功能填料，所述第二层析柱所采用的填料为亲和填料。
8、优选地，所述多功能填料的平均粒径为80～100μm，由激活的配基核心和惰性壳层组成，所述配基核心包括基质和配基，所述基质为高度交联结合琼脂糖，所述配基为辛胺。在纯化过程中，质粒dna由于其分子量较大被排阻在填料微球外部，以流穿的模式分离，而rna、宿主蛋白、宿主核酸及内毒素进入填料微球内部与辛胺基团结合，达到分离效果。因为该层析可同时除去rna及内毒素，所以无需额外添加絮凝剂及离子交换层析，结合亲和层析的开环除去功能，组合为高效的两步法层析工艺。
9、优选地，所述亲和填料的平均粒径为30～50μm，所述亲和填料的配基为嗜硫芳香族化合物。第二层析柱的主要作用是除去开环质粒，提高超螺旋质粒比例，其通过开环质粒与超螺旋质粒碱基暴露程度和表面电荷的强弱不同进行有效分离，并进一步降低内毒素含量。
10、根据一些具体实施方式，所述多功能填料为capto core 700。
11、根据一些具体实施方式，所述亲和填料为cytiva plasmidselect xtra。
12、优选地，所述含目的质粒的菌体裂解液为含目的质粒的大肠杆菌菌体裂解液。
13、优选地，所述目的质粒的大小为3kb-15kb。
14、优选地，所述步骤(1)中，所述过滤包括先后进行的一级过滤和二级过滤，所述一级过滤采用的是孔径为10μm～50μm的深层滤器，所述二级过滤采用的是孔径为0.22μm～0.45μm的囊氏滤器。
15、优选地，所述步骤(2)中，所述膜浓缩采用的是孔径为100kd～300kd的平板膜包和/或中空纤维膜。
16、优选地，所述平板膜包和/或中空纤维膜每平方米处理30～50l所述含目的质粒的大肠杆菌菌体裂解液。
17、优选地，所述膜浓缩的浓缩倍数为20～50倍。
18、优选地，所述步骤(2)中，所述换液采用的是膜包超滤的方式，所使用的置换液为：1～2.5m硫酸铵，5～15mm依地酸二钠，50～150mm氨丁三醇，余量水，所使用的置换液的ph值为7～8。
19、优选地，所述步骤(3)中，通过所述第一层析柱进行的层析分离步骤依次为：柱前清洗、平衡、上样、复平衡、洗杂。
20、其中，所述柱前清洗和洗杂分别包括水洗和naoh溶液冲洗；
21、所述平衡和所述复平衡采用的第一平衡液为：1～2.5m硫酸铵，5～15mm依地酸二钠，50～150mm氨丁三醇，余量水，所述第一平衡液的ph值为7～8；
22、所述上样使用步骤2的粗提溶液作为上样样本；
23、在所述上样阶段，当uv260高于100mau开始收样，直到在所述复平衡阶段，uv260低于100mau停止收样。
24、根据一些优选实施方式，通过所述第一层析柱进行的层析分离步骤具体如下：
25、用超纯水以300～500cm/h的流速冲洗所述第一层析柱，冲洗体积3～10cv；
26、用1m naoh与30％异丙醇的混合溶液以150～300cm/h的流速冲洗所述第一层析柱，冲洗体积3～10cv；
27、用超纯水以300～500cm/h的流速冲洗所述第一层析柱，冲洗体积3～10cv；
28、用所述第一平衡液以线性流速300～500cm/h过所述第一层析柱，平衡体积3～10cv；
29、用所述粗提溶液以线性流速150～300cm/h过所述第一层析柱，在uv260高于100mau开始收样；
30、用所述第一平衡液以线性流速300～500cm/h过所述第一层析柱，平衡体积3～10cv，uv260低于100mau停止收样；
31、用1m naoh与30％异丙醇的混合溶液以线性流速150～300cm/h冲洗所述第一层析柱，冲洗体积3～10cv；
32、用超纯水以300～500cm/h的流速冲洗所述第一层析柱，冲洗体积3～10cv。
33、优选地，所述步骤(3)中，通过所述第二层析柱进行的层析分离步骤依次为柱前清洗、平衡、上样、复平衡、洗脱，
34、其中，所述本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种质粒DNA的分离纯化方法，其特征在于：所述的分离纯化方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的质粒DNA的分离纯化方法，其特征在于：所述多功能填料的平均粒径为80～100μm，由激活的配基核心和惰性壳层组成，所述配基核心包括基质和配基，所述基质为高度交联结合琼脂糖，所述配基为辛胺；和/或，所述亲和填料的平均粒径为30～50μm，所述亲和填料的配基为嗜硫芳香族化合物。
3.根据权利要求2所述的质粒DNA的分离纯化方法，其特征在于：所述多功能填料为Capto Core 700；所述亲和填料为Cytiva PlasmidSelect Xtra。
4.根据权利要求1所述的质粒DNA的分离纯化方法，其特征在于：所述含目的质粒的菌体裂解液为含目的质粒的大肠杆菌菌体裂解液；和/或，所述目的质粒的大小为3Kb-15Kb。
5.根据权利要求1所述的质粒DNA的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述过滤包括先后进行的一级过滤和二级过滤，所述一级过滤采用的是孔径为10μm～50μm的深层滤器，所述二级过滤采用的是孔径为0.22μm～0
6.根据权利要求1所述的质粒DNA的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述膜浓缩采用的是孔径为100KD～300KD的平板膜包和/或中空纤维膜；和/或，所述膜浓缩的浓缩倍数为20～50倍。
7.根据权利要求1所述的质粒DNA的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述换液采用的是膜包超滤的方式，所使用的置换液为：1～2.5M硫酸铵，5～15mM依地酸二钠，50～150mM氨丁三醇，余量水，所使用的置换液的pH值为7～8。
8.根据权利要求1所述的质粒DNA的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤(3)中，通过所述第一层析柱进行的层析分离步骤依次为：柱前清洗、平衡、上样、复平衡、洗杂，
9.根据权利要求8所述的质粒DNA的分离纯化方法，其特征在于：通过所述第一层析柱进行的层析分离步骤具体如下：
10.根据权利要求1所述的质粒DNA的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤(3)中，通过所述第二层析柱进行的层析分离步骤依次为柱前清洗、平衡、上样、复平衡、洗脱，
11.根据权利要求9所述的质粒DNA的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤(3)中，通过所述第二层析柱进行的层析分离步骤具体如下：
12.根据权利要求1所述的质粒DNA的分离纯化方法，其特征在于：所述的分离纯化方法还包括对步骤(3)的所述质粒溶液进行换液的步骤，所使用的置换液为：0.5～1.5mM依地酸二钠，5～15mM氨丁三醇，余量水，所使用的置换液的pH值为7～8。
...【技术特征摘要】
1.一种质粒dna的分离纯化方法，其特征在于：所述的分离纯化方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的质粒dna的分离纯化方法，其特征在于：所述多功能填料的平均粒径为80～100μm，由激活的配基核心和惰性壳层组成，所述配基核心包括基质和配基，所述基质为高度交联结合琼脂糖，所述配基为辛胺；和/或，所述亲和填料的平均粒径为30～50μm，所述亲和填料的配基为嗜硫芳香族化合物。
3.根据权利要求2所述的质粒dna的分离纯化方法，其特征在于：所述多功能填料为capto core 700；所述亲和填料为cytiva plasmidselect xtra。
4.根据权利要求1所述的质粒dna的分离纯化方法，其特征在于：所述含目的质粒的菌体裂解液为含目的质粒的大肠杆菌菌体裂解液；和/或，所述目的质粒的大小为3kb-15kb。
5.根据权利要求1所述的质粒dna的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述过滤包括先后进行的一级过滤和二级过滤，所述一级过滤采用的是孔径为10μm～50μm的深层滤器，所述二级过滤采用的是孔径为0.22μm～0.45μm的囊氏滤器。
6.根据权利要求1所述的质粒dna的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述膜浓缩采用的是孔径为100kd～300kd的平板膜包和/或中...
【专利技术属性】
技术研发人员：许美玲，杨薇，柯尊阳，肖瑶，李晨，刘梦洁，任科云，叶炜，梁华，胡坤坤，左静，彭木，
申请(专利权)人：楷拓生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：
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