【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学分子生物，涉及一种检测粉纹夜蛾tnclv病毒的引物和探针组合及其应用。
技术介绍
1、截至2022年6月30日，全球累计批准162种抗体类药，其中美国批准122种，欧洲批准114种，日本批准82种和中国批准73种。新兴的抗体发现技术加速了抗体的开发，会将更多的抗体候选物领向临床开发，未来全球抗体治疗产业及其市场将大幅扩大。
2、大部分生物药(如单克隆抗体)以注射方式应用于疾病治疗，这些生物药的质量与患者的用药安全密切相关。各国监管机构出台了一系列法规来确保生物药的生物安全性，如法规中明确要求对生产用种子库细胞，对细胞培养结束时混悬液，动物组织原材料匀浆做病毒检测，即采用各种适宜的方法检测污染的病毒。
3、目前很多重组蛋白类生物制品以昆虫细胞系作为表达宿主。这些昆虫细胞主要包括了鳞翅目(lepidoptera)的sf和tn细胞系，双翅目(diptera)的s2细胞系等。其中，tn细胞系的一个优点是可以产生比其他昆虫来源的细胞系(例如sf细胞)更高水平的重组蛋白。然而，tn细胞系持续感染一种α野田村病毒tn5细胞系病毒(tnclv)，因此降低了其作为杆状病毒昆虫细胞表达系统的实用性。尽管如此，2010年fda通过了使用tn5细胞系生产一款女性使用二价人乳头瘤病毒疫苗(hpv2，cervarix)。此外，该细胞也用于另一款人乳头瘤病毒16l1病毒样颗粒疫苗的生产中。目前，业界已研发出无tnclv感染的tn细胞系，例如msu-tnt4,qau-bti-tn9-4s,qb-cl-b,bti-tna
4、目前，指导原则中推荐的用于生物安全检测的病毒检测方法包含了体外法，体内法，动物抗体产生试验，电镜，elisa，pcr，rt检测等。其中，体外法采用敏感细胞系进行共培养检测，在适宜的培养时间点(通常为28天)取样检测感染性病毒。在没有可靠的体外试验方法时，可采用适宜动物进行接种盲传试验，采用体内法检测有无感染性病毒。对于尚没有合适的体内和体外病毒检测方法时，可采用不同的动物，观察种特异病毒的抗体产生情况。以上方法由于检测周期较长，实验操作繁琐，实验动物伦理等原因，在一定程度上限制了其应用范围。核酸检测技术检测周期短，操作便利，无需动物，因此适用范围较广，且灵敏度较高，检测周期短，是tnclv病毒检测的一种较好的选择。
5、聚合酶链式反应(pcr)是检测目标核酸片断的有力工具，pcr通过热循环驱动扩增。从1981年专利技术该技术以来，多种改进程序被引入以满足分子生物学领域的科研需求。定量pcr(qpcr,q-pcr)被广泛用于细胞中核酸的定量以及检测目标蛋白的表达水平。该技术已被开发应用于病毒检测以及病毒清除研究。qpcr主要的方法学是通过实时监测荧光强度来检测pcr产物的含量。而在常规pcr中，扩增产物通过电泳进行分离和可视化。qpcr中使用的dna聚合酶具有5’至3’的核酸内切酶活性，通过水解标记有荧光素和淬灭染料的寡核苷酸探针，产生荧光信号。将qpcr和荧光素标记探针相结合，理论上可以检测单个病毒dna/rna，在实际应用中qpcr可以检测到样品中个位数的病毒dna/rna，无论病毒的活性如何。目前，将qpcr用于外源性因子检测的例子是进行外源病毒因子检测，例如检测一些用于生产生物制品的工程细胞系的主细胞库(mbc)，工作细胞库(wbc)是否存在特定的病毒。中国药典规定，针对人源细胞系，应考虑检测人eb病毒，人巨细胞病毒(hcmv)，人逆转录(hiv-1/2，htlv1/2，人肝炎病毒(hav，hbv，hcv)，人细小病毒b19，人乳头瘤病毒，人多瘤病毒，难培养的人腺病毒和人疱疹病毒-6/7/8等。另外，2020版中国药典增加了pcr(qpcr)检查方法，为荧光定量技术在病毒检测和生物制品安全评价的应用提供了法规依据。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种检测粉纹夜蛾tnclv病毒的引物和探针组合及其应用。本专利技术针对所有不同基因型的tnclv病毒，设计对应的正反向引物、探针以及反应程序，建立一种具有良好专一性、灵敏性以及抗抑制等优点的实时定量pcr法，且该检测方法适用于生物制品大批量生产的繁复检测。
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种检测粉纹夜蛾tnclv病毒的引物和探针组合，所述引物和探针组合包括检测粉纹夜蛾tnclv病毒蛋白质a编码序列的引物和探针组合；
4、所述引物和探针组合包括：正向引物、反向引物和探针；
5、所述正向引物的核苷酸序列包括seq id no:1所示的序列，所述反向引物的核苷酸序列包括seq id no:2所示的序列；
6、所述探针的核苷酸序列包括seq id no:3所示的序列。
7、seq id no:1：aaccagcgtagaagccgg。
8、seq id no:2：ccaatgagtgcatcgacctg。
9、seq id no:3：fam-tggccacagcacccgcaagacgcccatt-bhq1。
10、本专利技术针对所有不同基因型的tnclv病毒，设计对应的正反向引物、探针以及反应程序，建立一种具有良好专一性、灵敏性以及抗抑制等优点的实时定量pcr法，且该检测方法适用于生物制品大批量生产的繁复检测。
11、优选地，所述探针的5’端修饰荧光素，所述探针的3’端修饰淬灭剂。
12、优选地，所述荧光素选自fam、vic或hex中任意一种。
13、优选地，所述淬灭剂选自mgb、bhq1或tamra任意一种。
14、优选地，所述正向引物和反向引物扩增的目的片段的序列包括seq id no:4所示的序列。
15、seq id no:4：
16、gcgtcgaaggttatctttgtaccgatgcgcttactccgttgatatcggattattgcaaaatggtactacggttatacgggccaactgcctccacagaggaagttaggaaccagcgtagaagccggaataaggagaaaccctactggttgacgtgtaatggatcctggccacagcacccgcaagacgcccatttgatgaagcaggttttaatcaagcgtactggaattgacgaagatcaggtcgatgcactcattgggcgttttgccgcaatgaaggatgtctgggagaagattacacatgacagcga本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测粉纹夜蛾TnCLV病毒的引物和探针组合，其特征在于，所述引物和探针组合包括检测粉纹夜蛾TnCLV病毒蛋白质A编码序列的引物和探针组合；
2.根据权利要求1所述的检测粉纹夜蛾TnCLV病毒的引物和探针组合，其特征在于，所述探针的5’端修饰荧光素，所述探针的3’端修饰淬灭剂；
3.一种检测粉纹夜蛾TnCLV病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的检测粉纹夜蛾TnCLV病毒的引物和探针组合。
4.根据权利要求3所述的检测粉纹夜蛾TnCLV病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括病毒核酸标准品和荧光定量PCR反应试剂；
5.根据权利要求3或4所述的检测粉纹夜蛾TnCLV病毒的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，所述荧光定量PCR体系按终浓度计包括：Taqman FastVirus 1-Step Master Mix 1X、800-900nM正向引物、800-900nM反向引物、220-250nM探针；
7.一种检测粉纹夜蛾TnCLV病毒的系统，其特征在于，所述系统包括：
8.一种检测粉纹夜蛾TnCLV病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：
9.根据权利要求8所述的检测粉纹夜蛾TnCLV病毒的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR体系按终浓度计包括：Taqman Fast Virus 1-Step Master Mix1X、800-900nM正向引物、800-900nM反向引物、220-250nM探针；
10.根据权利要求1或2所述的检测粉纹夜蛾TnCLV病毒的引物和探针组合、权利要求3或4所述的检测粉纹夜蛾TnCLV病毒的试剂盒或权利要求7所述的检测粉纹夜蛾TnCLV病毒的系统中的任意一种或至少两种的组合在制备检测粉纹夜蛾TnCLV病毒的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种检测粉纹夜蛾tnclv病毒的引物和探针组合，其特征在于，所述引物和探针组合包括检测粉纹夜蛾tnclv病毒蛋白质a编码序列的引物和探针组合；
2.根据权利要求1所述的检测粉纹夜蛾tnclv病毒的引物和探针组合，其特征在于，所述探针的5’端修饰荧光素，所述探针的3’端修饰淬灭剂；
3.一种检测粉纹夜蛾tnclv病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的检测粉纹夜蛾tnclv病毒的引物和探针组合。
4.根据权利要求3所述的检测粉纹夜蛾tnclv病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括病毒核酸标准品和荧光定量pcr反应试剂；
5.根据权利要求3或4所述的检测粉纹夜蛾tnclv病毒的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，所述荧光定量pcr体系按终浓度计包括：taqman ...
【专利技术属性】
技术研发人员：龚圆昊，贾雪卿，秦冲，韩婷，董元舒，童涌，
申请(专利权)人：上海药明检测有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。