【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于化学分析，具体涉及一种气相色谱串联质谱技术检测尿液55种有机酸和糖醇的方法。
技术介绍
1、人体内随时都在进行成千上万的生物化学反应来维持自身的生长、发育及能量代谢，这些生化反应在正常情况下会逐步通过各种循环顺利进行，其中每一步反应都需要特定的酶来催化，目前还无法直接检测人体体内酶的活性，但是每种酶发挥作用都需要特定的辅酶来帮助，通常是指营养素，如b族维生素、微量元素等，当这些营养元素缺乏时，会导致酶不能正常工作，从而造成人体内部分物质代谢受阻，蓄积进入尿液。
2、有机酸和糖醇代谢分析就是通过检测尿液中有机酸和糖醇来分析肠道吸收同化作用、能量代谢、生物转化、信息交换等系统是否存在生理失衡，如果能及时发现并通过有效的干预纠正这些生理失衡，那么就能祛除疾病发生的根源，从而达到防止疾病的发生和发展的目的。
3、目前针对尿液中有机酸和糖醇浓度检测的方法主要为超高效液相串联质谱法或气相色谱串联质谱法，现有的文献或专利中相关检测方法检测效果并不理想；如专利cn113777189a，检测尿液中的3-甲基巴豆酰甘氨酸和3-羟基异戊酸，其中涉及到了加入盐酸羟胺进行肟化，但是上述二者均未给出肟化的反应条件，在酸性条件下肟化反应进行不充分，而盐酸羟胺是酸性的，因此上述肟化对检测起到的效果并不理想；再如专利cn113777188a，是对尿液中戊二酸、3-羟基戊二酸以及戊烯二酸进行检测，也涉及到了肟化反应，但是这三种物质均不含有羰基，肟化反应是将羰基(c＝o)转化为肟(c＝no)，因此该专利根本无需肟化，加入肟化无法
4、而尿液中有机酸和糖醇种类繁多，其中3-羟基丁酸，甲基丙二酸，苯甲酸，3-甲基-2-氧代戊酸，4-甲基-2-氧代戊酸，α-酮异戊酸、吡啶-2-羧酸，富马酸，3-苯基丙酸，柠苹酸，苹果酸，己二酸，焦谷氨酸，α-酮戊二酸，酒石酸，2,3-吡啶二甲酸，阿拉伯糖醇，顺式乌头酸，乳清酸，异柠檬酸，2-甲基马尿酸，2-羟基马尿酸，3-羟基丙酸，2-羟基异戊酸，2-羟基异己酸，4-羟基苯乳酸，苯乳酸，戊二酸，丙二酸，4-羟基苯丙酮酸，尿黑酸，n-乙酰基-l-天冬氨酸，苯丙酮酸，苯乙酸，癸二酸，3,4-二羟基苯基丙酸等有机酸属于营养素的代谢产物、肝脏解读标记物及肠道菌群标记物，它们在尿液中的含量可以帮助判断人体内营养素的代谢水平、肝脏的代谢能力及肠道中菌群是否失衡等。
5、因此开发一种既能精确定量，又能一次性同时分析尿液中多种有机酸和糖醇的检测方法是当务之急。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术提供了一种气相色谱串联质谱技术检测尿液55种有机酸和糖醇的方法。使用气相色谱质谱联用技术对尿液中55种有机酸和糖醇进行全定量一次性分析检测，采用酶解-肟化-液液萃取-硅烷化衍生的前处理方式，提高待测物响应及稳定性。根据定量结果，可对人体代谢进行解读。定量下限可达到0.5μg/ml,处理后的样本在室温下10天内稳定，4℃和-20℃保存条件下10天内稳定。批间和批内精密度小于15％，使用气相色谱质谱联用技术进行检测，准确定量。
2、本专利技术提及的55种有机酸和糖醇为：乳酸，2-羟基丁酸，丙酮酸，3-羟基丁酸，β-羟基异戊酸，甲基丙二酸，苯甲酸，3-甲基-2-氧代戊酸，4-甲基-2-氧代戊酸，α-酮异戊酸，琥珀酸，吡啶-2-羧酸，富马酸，3-苯基丙酸，柠苹酸，苹果酸，己二酸，焦谷氨酸，苯乙酮酸，3-羟基-3-甲基戊二酸，4-羟基苯甲酸，α-酮戊二酸，4-羟基苯乙酸，酒石酸，辛二酸，丙三羧酸，2,3-吡啶二甲酸，阿拉伯糖醇，顺式乌头酸，乳清酸，高香草酸，柠檬酸，异柠檬酸，马尿酸，香草扁桃酸，2-甲基马尿酸，3-吲哚乙酸，5-羟基吲哚-3-乙酸，2-羟基马尿酸，3-羟基丙酸，2-羟基异戊酸，2-羟基异己酸，4-羟基苯乳酸，苯乳酸，乙基丙二酸，杏仁酸，戊二酸，丙二酸，4-羟基苯丙酮酸，尿黑酸，n-乙酰基-l-天冬氨酸，苯丙酮酸，苯乙酸，癸二酸，3,4-二羟基苯基丙酸。
3、常见的气相色谱法检测有机酸和糖醇时，常采用丁酯衍生化，但无法检出大部分上述有机酸和糖醇；本专利技术先使用盐酸羟胺对尿液进行肟化，再进行硅烷衍生化，能够一方面放大有机酸和糖醇的信号，便于检测，另一方面错开色谱峰，使有机酸和糖醇的色谱峰区分开，使得尿液中55种有机酸和糖醇的检测得以进行，同时提高检测的精密度和准确性，定量下限可达0.5μg/ml。
4、在上述肟化中，我们限定了肟化反应的条件是在碱性条件下，特别是当ph＝8.2～9的条件下，在这一条件下才能使本专利技术提供的技术方案想要检测的55种有机酸和糖醇全部被检出，且在这一条件下的前处理后，在4℃的温度下储存10天后，55种有机酸和糖醇仍然可以被全部检出，对尿液有机酸和糖醇检测的实际应用有极大有益效果。
5、本专利技术提供了一套对尿液中有机酸和糖醇检测的前处理方法，前处理流程为：酶解-肟化-液液萃取-硅烷化；经过该前处理方法，尿液样本具有良好的稳定性，能够在4℃和-20℃保存条件下10天内稳定，具有实际应用价值。
6、本专利技术还提供了优化的仪器检测升温程序，在此升温程序下，有机酸和糖醇的色谱峰能呈现出更好的峰型，各峰之间区分度高，这一升温程序使得55种有机酸和糖醇均能被检测出，且进一步提高了检测的准确性和灵敏度。
7、塑料耗材会对本专利技术的55种有机酸和糖醇引入不可控的误差，每一次引入的误差不同、对每一种检测指标引入的误差不同；本专利技术使用玻璃材质的耗材(例如在进行样本前处理中，用于装载尿液样本的为玻璃离心管、玻璃滴管进行前处理的容器)，一方面降低了55种有机酸和糖醇在气相色谱下的背景噪声，提高了检测的准确性，另一方面防止了塑料中相关物质可能与尿液样本的微量有机酸和糖醇发生相互作用，进一步提高了检测的精密度和准确性，提高了检测的灵敏度；同时，在玻璃材质的耗材下进行前处理，处理后的尿液样本能够保持稳定，能够在4℃和-20℃保存条件下10天内稳定。
8、所以，本专利技术一方面，本专利技术提供了一种气相色谱串联质谱技术检测尿液中有机酸和糖醇的方法，包括以下步骤：
9、(1)酶解：在玻璃离心管内加入脲酶，加入样本，进行酶解；
10、(2)肟化：在玻璃离心管内再加入肟化试剂和naoh溶液进行肟化反应，反应结束后加入hcl溶液中和；
11、(3)液液萃取：加入乙酸乙酯，振荡并离心，用玻璃吸管移取上清至玻璃离心管；
12、(4)硅烷衍生化：氮气吹干，加入硅烷化衍生试剂，孵育；
13、(5)上机检测。
14、在一些方式中，所述有机酸和糖醇为乳酸，2-羟基丁酸，丙酮酸，3-羟基丁酸，β-羟基异戊酸，甲基丙二酸，苯甲酸，3-甲基-2-氧代戊酸，4-甲基-2-氧代戊酸，α-酮异戊酸，琥珀酸，吡啶-2-羧酸，富马酸，3-苯基丙酸，柠苹酸，苹果酸，己二酸，焦谷本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种气相色谱串联质谱技术检测尿液中有机酸和糖醇的方法，其特征在于，所述的方法包括以下顺序的步骤：
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(2)中，肟化试剂包括羟胺乙醇、盐酸羟胺、硫酸羟胺。
3.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(2)中，肟化试剂的浓度为1％-10％；肟化试剂与酶解后样本体积比为1:1-4。
4.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述离心管和吸管为玻璃材质。
5.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(4)中，硅烷化衍生试剂包括BSTFA-TMCS、MSTFA-TMCS、HDMS-TMCS、三甲基氯硅烷、三乙基氯硅烷。
6.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(5)中，上机检测时设定有升温程序：100℃保持4min，以4℃/min的速度升温至280℃，保持11min。
7.一种试剂组合用于制备提高尿液样本中有机酸和糖醇的稳定性的制剂上的用途，其特征在于，所述试剂组合包括肟化试剂、NaOH溶液和硅烷化衍生化试剂，所述肟化试剂为羟胺乙醇或盐酸羟胺，所述尿液样本添加Na
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述硅烷化衍生化试剂包括BSTFA-TMCS、MSTFA-TMCS、HDMS-TMCS、三甲基氯硅烷、三乙基氯硅烷。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的稳定性是为通过肟化试剂和硅烷化衍生化试剂处理后的尿液样本能够在-4℃或者-20℃下保存10天；提高稳定性指降低尿液样本中的有机酸的降解速率，有机酸仍能被气相色谱串联质谱检出。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的用途还包括处理尿液样本的方法，所述的方法包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种气相色谱串联质谱技术检测尿液中有机酸和糖醇的方法，其特征在于，所述的方法包括以下顺序的步骤：
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(2)中，肟化试剂包括羟胺乙醇、盐酸羟胺、硫酸羟胺。
3.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(2)中，肟化试剂的浓度为1％-10％；肟化试剂与酶解后样本体积比为1:1-4。
4.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述离心管和吸管为玻璃材质。
5.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(4)中，硅烷化衍生试剂包括bstfa-tmcs、mstfa-tmcs、hdms-tmcs、三甲基氯硅烷、三乙基氯硅烷。
6.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(5)中，上机检测时设定有升温程序：100℃保持4min，以4℃/min的速度升温至280℃，保持11min。
7.一种试剂组合用于制备提高尿液样本中有机酸和糖醇的稳定性的制剂上的用途，其特征在于，所述试剂组合包括肟化试剂、naoh溶液和硅烷化衍生化试剂，所述肟化试剂为羟胺乙醇或盐酸羟胺，所述尿液样本添加naoh溶液后ph值为8.2～9；所述有机酸和糖醇为乳酸，2-羟基丁酸，丙酮酸，3-羟基丁酸，β-羟基异戊酸，甲基丙二酸，苯甲酸，3-甲基-2-氧代戊酸，4...
【专利技术属性】
技术研发人员：孔子青，李婧，沈凌晓，刘华芬，
申请(专利权)人：北京凯莱谱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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