【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，涉及一种鼠源膜突蛋白的碳末端结构域(ctd)制备。所述结构域对于研究膜突蛋白的结构及功能具有重要意义。
技术介绍
1、膜组织延伸刺突蛋白，简称膜突蛋白，是一种存在于子宫中的膜蛋白(biochem j,1998,251:831)。膜突蛋白具有577个氨基酸，分子量约为67kda，属于erm蛋白家族成员。膜突蛋白具有三个结构域，它们分别是n-末端ferm结构域、中心螺旋结构域和c-末端结构域(ctd，biol cell,2012,92:305)。在无活性的静息状态下，膜突蛋白的ferm和ctd相互作用，掩盖肌动蛋白结合位点、膜结合位点和蛋白质相互作用位点(cell,2000,101:259)。而活性构象的转变涉及蛋白与质膜脂质磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(pip2)的结合以及特定c末端苏氨酸残基t558的磷酸化(cell biol,2004,164:653)，其中c末端磷酸化被认为是膜突蛋白活性所必需的步骤(cell biol,2012,199:969)。
2、膜突蛋白参与多种生理过程(infect immun,1999,67:460)，实验结果还证实其在某些癌症的发生、发展过程中发挥作用。因此深入研究膜突蛋白对于了解相关生命过程的分子生物学机制、肿瘤发病机理及疾病的治疗具有重要的研究意义。
3、作为moesin蛋白发挥功能以及连接细胞骨架的关键结构域，ctd在膜突蛋白激活过程中起到重要的作用。为了对其进行系统性的研究，需要进行高效的制备，但是目前缺乏专一和系统性的制备方法。虽然其它蛋白碳
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种提取膜突蛋白调节活化状态的重要结构域的方法，可以体外研究膜突蛋白的激活状态。并且对于一些膜突蛋白异常活化导致的疾病治疗提供一种研究思路。
2、利用基因工程手段对鼠源膜突蛋白ctd的编码基因进行改造得到重组蛋白编码的基因序列，其核苷酸序列为seq id no：1所述，包含tev酶酶切位点和组氨酸亲和标签(6×his)，其氨基酸序列如seq id no：2所示。所述核苷酸序列是在鼠源膜突蛋白的ctd的编码基因核苷酸序列进行密码子优化，得到偏好于大肠肝菌表达的核苷酸序列。具体步骤为：根据ctd的基因序列和pet-28a载体信息设计扩增ctd基因上下游引物，通过pcr手段扩增得到ctd基因。
3、扩增上游引物序列：5’-cat cac agc agc ggc gaa ttc gaa aac ctg tat tttcag ggtatg c-3’；
4、扩增下游引物序列：5’-gtg gtg gtg gtg gtg ctc gag tta gtc agg ctt gcgccg-3’；
5、进一步地，将ctd基因与载体pet-28a基因进行双酶切获得ctd基因片段和空载体基因片段；再通过t4 dna连接酶的作用下将基因片段与空载体连接，获得重组质粒；
6、进一步地，将重组质粒转化大肠杆菌表达细胞bl21(de3)中，通过亲和层析提取、离子交换层析纯化，获得高纯度重组蛋白；
7、进一步地，通过tev酶酶切重组蛋白上的组氨酸亲和标签(6×his)；
8、进一步地，通过亲和层析去除tev蛋白酶得到鼠源膜突蛋白ctd。
9、与现有技术相比，本专利技术所提供的技术方案的优势是：
10、1、本专利技术公开的膜突蛋白ctd制备方法便捷高效，设计的扩增ctd的引物在结合上具有特异性。
11、2、本专利技术公开的膜突蛋白ctd制备能够提取高纯度且稳定性能高的蛋白。
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1.一种用于制备鼠源膜突蛋白CTD结构域的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
2.权利要求1所述的重组蛋白的核苷酸序列，其特征在于，根据鼠源膜突蛋白CTD结构域的编码基因核苷酸序列进行密码子优化，得到偏好于大肠杆菌表达的核苷酸序列。
3.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利2所述的核苷酸、组氨酸标签和蛋白酶酶切位点。
4.含有权利要求3所述的重组表达载体的重组宿主细胞。
5.权利要求4所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述的重组宿主细胞为E.coliBL21(DE3)。
6.权利要求1所述的重组蛋白的表达及纯化，其特征在于，包括如下步骤：构建重组表达载体、转化宿主细胞、菌种培养、诱导直到表达出重组蛋白，并且进行纯化。
7.鼠源膜突蛋白CTD结构域的制备，其特征在于，通过TEV蛋白酶对权利要求6获得的重组蛋白进行酶切。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：TEV酶切的具体步骤包括配制反应混合物、4℃金属浴反应10h、亲和层析去除TEV蛋白酶
9.权利要求8所述的方法，其特征在于，所需的缓冲液为Tris-HCl缓冲液，缓冲液的pH＝7.5。
...【技术特征摘要】
1.一种用于制备鼠源膜突蛋白ctd结构域的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列如seq id no：1所示；
2.权利要求1所述的重组蛋白的核苷酸序列，其特征在于，根据鼠源膜突蛋白ctd结构域的编码基因核苷酸序列进行密码子优化，得到偏好于大肠杆菌表达的核苷酸序列。
3.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利2所述的核苷酸、组氨酸标签和蛋白酶酶切位点。
4.含有权利要求3所述的重组表达载体的重组宿主细胞。
5.权利要求4所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述的重组宿主细胞为e.colibl21(de3)...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄方，朱文慧，张庆硕，虎祥，钱爱枝，赵锦程，王晓娟，
申请(专利权)人：中国石油大学华东，
类型：发明
国别省市：
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