【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于神经生物学，具体涉及双重跨突触标记系统及其标记和使用方法。
技术介绍
1、大脑不同脑核团之间的信息交流主要通过神经元的突触传递进行，轴突末梢的突触常常与其他神经元的树突进行连接,从而进行信息传递和发挥功能。在神经科学的解剖-结构-功能学研究中，往往需要神经示踪剂追踪不同脑核团之间神经元的上下游联系，而尤为重要的是需要跨一级的神经示踪技术才能准确地进行神经环路描绘。
2、按照在神经元中的传播方向，神经示踪剂可以分为顺行示踪剂和逆行示踪剂。顺行示踪剂通常从神经元的胞体进入，再从胞体向轴突末梢传播，从而标记出神经元轴突的投射脑核团(顺行非跨突触)，或跨突触后标记出下一级神经元(顺行跨突触)；逆行示踪剂在神经元的突触末梢被吸收后再逆向至胞体传播(逆行非跨突触)，或在神经元突触末梢表达后通过跨突触标记出上一级神经元(逆行跨突触)，从而标记该脑区的上游输入脑核团。其中非跨突触的示踪剂包括化学示踪剂和病毒示踪剂。常用的化学示踪剂包括顺行示踪剂葡聚糖胺(bdas)，逆行示踪剂霍乱毒素b亚基(cholera toxin b subunit,ctb)、荧光金(fluor gold,fg)、固蓝等；常用的示踪病毒包括顺行1型血清型和逆行2型血清型腺相关病毒(adeno-associated virus,aav，aav1/antero和aav2/retro)。上述这些非跨突触示踪剂都是经轴突末梢摄取后逆行至神经元的胞体，很难区分同一脑核团内不同类型神经元的上游支配脑核团和神经元输入，因此这类示踪剂通常用于研究脑区和脑区之间的连
3、经过研究人员改造后狂犬病毒(rabies virus,rv)系统只能跨单突触逆行感染上一级神经元。囊膜糖蛋白(rabies glycoprotein,rg)是负责逆行跨突触的必需蛋白。若rg蛋白缺失，rv-δg便会丧失跨突触的能力，只能停留在本级神经元中，但是其基因组的复制和转录却不会受到影响。敲除rv病毒的表面囊膜蛋白基因，这样改造后rv病毒不再具备跨突触的能力，毒性大大降低；rv中同时加入了各种荧光蛋白基因，病毒表达后荧光蛋白即可点亮标记的神经元。为了利用rv逆向跨级的特点，实现逆向跨一级标记的目的，研究者将rv病毒的表面囊膜蛋白替换为禽类白血病病毒的囊膜蛋白enva，这类囊膜蛋白在哺乳动物中没有受体，因此这类rv-enva病毒不能单独感染小鼠的神经元。然后利用腺相关病毒aav作为辅助病毒搭载enva的受体肿瘤病毒a(tumor virus a,tva)和rv-enva病毒跨突触所需的rg。将辅助病毒aav和rv-enva病毒注射到小鼠同一个脑区时，该区域神经元会同时被aav和rv感染。表达tva的神经元会被rv-enva感染，rv-enva借助aav表达的rg，可以组装成完整的rv病毒粒子，并逆行跨一级感染上一级神经元，由于上一级神经元并没有rg，就会停止进一步逆向标记上一级神经元，从而实现了逆向跨一级标记的目的。与此同时，为了确定某种类型神经元的上游输入，可以利用cre-loxp或flpo-frt系统结合特定类型的cre或flpo转基因小鼠和含有dio或fdio元件的aav辅助病毒，特异性标记目标类型的神经元，示踪其上游输入情况。
4、但是，目前仅仅只有rv这一种逆行跨单突触标记的病毒标记方法，无法同时观察同一脑核团内两种不同类型神经元的上游输入神经元位置和分布，也不能比较同一脑核团内两种不同类型神经元接受上游脑核团支配的神经元数量。因此，需要在此基础上进一步拓展其在神经环路示踪中的应用，进行同一脑核团内不同类型神经元上游神经投射的示踪或者特定神经元类型的多级跨单突触上游神经环路示踪。该类工具的开发对脑图谱的绘制具有重要贡献。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种双重跨突触标记系统及其标记和使用方法，以便同时观察和比较脑核团不同类型神经元的上游输入神经元的差异，以及脑核团特定类型神经元的二级跨单突触联系，从而有助于精确描绘脑核团特定类型神经元的神经输入脑图谱。
2、本专利技术提供的双重跨突触标记系统，是将逆行跨单突触病毒(狂犬病毒rabiesvirus，rv)和能跨突触的化学示踪剂麦胚凝集素(wheat germ agglutinin,wga)在动物中枢神经系统中进行组合标记；具体地，本专利技术是将神经元类型特异性表达系统结合rv和腺相关病毒携带wga表达的双病毒系统，标记脑核团的两类不同类型神经元，进而观察和比较同一脑区的不同类型神经元的上游投射；使用该双病毒系统中rv标记某脑核团特定类型神经元，使用wga系统标记该脑核团特定类型神经元的上一级神经元，实现二级跨单突触标记。这样，可以同时观察和比较脑核团不同类型神经元的上游输入神经元的差异，以及脑核团特定类型神经元的二级跨单突触联系，从而有助于精确描绘脑核团特定类型神经元的神经输入脑图谱。
3、本专利技术采用rv逆行跨单突触标记系统，利用cre-loxp或flpo-frt系统，以及依赖cre或flpo才能进行rg蛋白和tva受体表达的病毒(aav-ee1α-dio-orvg-wpre-da，aav-ef1α-dio-h2b-egfp-t2a-tva-wpre-pa，或aav-ee1α-fdio-orvg-wpre-da，aav-ef1α-fdio-h2b-egfp-t2a-tva-wpre-pa)，结合特定神经元类型驱动cre或flpo表达的工具小鼠和上述cre或flpo依赖的病毒，在特定类型神经元表达表达rg和tva。在此基础上，同一脑核团注射rv-enva，表达tva的神经元会被rv感染，rv借助aav表达的rg，可以组装成完整的rv病毒粒子，并跨一级感染上一级神经元，从而实现特定类型神经元(cre或flpo表达的神经元)的上游投射神经元的标记。
4、本专利技术采用能跨突触的化学示踪剂麦胚凝集素(wga)，利用cre-loxp或flpo-frt系统，构建依赖cre或flpo才能进行wga表达的病毒：aav-ee1α-dio-wga-wpre-pa和aav-ee1α-fdio-wga-wpre-pa。本专利技术还构建了神经元特异性表达flpo的工具小鼠(th-flpo)，并将购买的gad2-cre和th-flpo两种工具鼠进行交配，获得gad2-cre::th-flpo双阳性工具小鼠。结合特定神经元类型驱动cre或flpo表达的工具小鼠和上述cre或flpo依赖的aav病毒，在特定类型神经元表达wga，待wga实现跨突触传递后，再进行脑切片和wga染色，从而实现特定类型神经元(cre或flpo表达的神经元)的上游投射神经元的标记。
5、结合上述工具小鼠和跨突触逆行标记系统，本专利技术还提供两种使用方法：
6、第一种，先获得cre和flpo两种工具小鼠本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种双重跨突触标记系统，其特征在于，是将逆行跨单突触病毒(RV)和能跨突触的化学示踪剂麦胚凝集素(WGA)在动物中枢神经系统中进行组合标记；具体地，是将神经元类型特异性表达系统结合RV和腺相关病毒携带WGA表达的双病毒系统，标记脑核团的两类不同类型神经元，进而观察和比较同一脑区的不同类型神经元的上游投射；使用该双病毒系统中RV标记某脑核团特定类型神经元，使用WGA系统标记该脑核团特定类型神经元的上一级神经元，实现二级跨单突触标记。
2.一种如权利要求1所述双重跨突触标记系统的标记方法，其特征在于，包括采用能跨突触的化学示踪剂麦胚凝集素(WGA)，利用Cre-LoxP或FlpO-Frt系统，构建依赖Cre或FlpO进行WGA表达的病毒：AAV-EE1α-DIO-WGA-WPRE-pA和AAV-EE1α-fDIO-WGA-WPRE-pA，并且构建神经元特异性表达FlpO的工具小鼠；结合特定神经元类型驱动Cre或FlpO表达的工具小鼠和上述Cre或FlpO依赖的AAV病毒，在特定类型神经元表达WGA，待WGA实现跨突触传递后，再进行脑切片和WGA染色，从而实现特定类型神
3.根据权利要求2所述的标记方法，其特征在于，采用RV逆行跨单突触标记系统，利用Cre-LoxP或FlpO-Frt系统，以及依赖Cre或FlpO才能进行RG蛋白和TVA受体表达的病毒：AAV-EE1α-DIO-ORVG-WPRE-DA，AAV-EF1α-DIO-H2B-EGFP-T2A-TVA-WPRE-PA，或AAV-EE1α-fDIO-ORVG-WPRE-DA，AAV-EF1α-fDIO-H2B-EGFP-T2A-TVA-WPRE-PA；结合特定神经元类型驱动Cre或FlpO表达的工具小鼠和上述Cre或FlpO依赖的病毒，在特定类型神经元表达表达RG和TVA；在此基础上，同一脑核团注射RV-EnvA，表达TVA的神经元会被RV感染，RV借助AAV表达的RG，组装成完整的RV病毒粒子，并跨一级感染上一级神经元，实现特定类型神经元即Cre或FlpO表达的神经元的上游投射神经元的标记。
4.一种如权利要求1所述双重跨突触标记系统的使用方法，其特征在于，结合所述工具小鼠和跨突触逆行标记系统，提供两种使用方法：
5.根据权利要求4所述的使用方法，其特征在于，所述逆行跨单突触狂犬病毒系统，病毒均以病毒注射液形式使用，其中包括Cre重组酶表达依赖的AAV-EE1α-DIO-ORVG-WPRE-DA，AAV-EF1α-DIO-H2B-EGFP-T2A-TVA-WPRE-PA腺相关病毒，FlpO重组酶表达依赖的AAV-EE1α-fDIO-ORVG-WPRE-DA，AAV-EF1α-fDIO-H2B-EGFP-T2A-TVA-WPRE-PA腺相关病毒，狂犬病毒RV-CVS-ENVA-N2C(deltaG)-tdTomato和RV-CVS-ENVA-N2C(deltaG)-mCherry-FlpO。
6.根据权利要求4所述的使用方法，其特征在于，所述的携带WGA的腺相关病毒系统，所涉及的病毒以病毒注射液形式使用，其中包括Cre重组酶表达依赖的AAV-EE1α-DIO-WGA-WPRE-pA和FlpO重组酶表达依赖的AAV-EE1α-fDIO-WGA-WPRE-pA腺相关病毒。
...【技术特征摘要】
1.一种双重跨突触标记系统，其特征在于，是将逆行跨单突触病毒(rv)和能跨突触的化学示踪剂麦胚凝集素(wga)在动物中枢神经系统中进行组合标记；具体地，是将神经元类型特异性表达系统结合rv和腺相关病毒携带wga表达的双病毒系统，标记脑核团的两类不同类型神经元，进而观察和比较同一脑区的不同类型神经元的上游投射；使用该双病毒系统中rv标记某脑核团特定类型神经元，使用wga系统标记该脑核团特定类型神经元的上一级神经元，实现二级跨单突触标记。
2.一种如权利要求1所述双重跨突触标记系统的标记方法，其特征在于，包括采用能跨突触的化学示踪剂麦胚凝集素(wga)，利用cre-loxp或flpo-frt系统，构建依赖cre或flpo进行wga表达的病毒：aav-ee1α-dio-wga-wpre-pa和aav-ee1α-fdio-wga-wpre-pa，并且构建神经元特异性表达flpo的工具小鼠；结合特定神经元类型驱动cre或flpo表达的工具小鼠和上述cre或flpo依赖的aav病毒，在特定类型神经元表达wga，待wga实现跨突触传递后，再进行脑切片和wga染色，从而实现特定类型神经元即cre或flpo表达的神经元的上游投射神经元的标记。
3.根据权利要求2所述的标记方法，其特征在于，采用rv逆行跨单突触标记系统，利用cre-loxp或flpo-frt系统，以及依赖cre或flpo才能进行rg蛋白和tva受体表达的病毒：aav-ee1α-dio-orvg-wpre-da，aav-ef1α-dio-h2b-egfp-t2a-tva-wpre-pa，或aav-ee1α-fdio-orvg-wpre-da，aav-ef...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘星，马兰，吕彦帛，蒋韵纯，王菲菲，李媛，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。