【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
专利
本专利技术涉及包含至少一种由两个氨基酸组成的二肽和至少一种微量金属离子的组合物，所述氨基酸是天然氨基酸并且至少一个所述氨基酸是半胱氨酸(cys)。此外，本专利技术涉及生物技术生产方法。更具体地，本专利技术涉及用于生物技术生产方法的改进的培养基、使用此类改进的培养基的方法、以及从使用所述改进的培养基的方法获得的产品。
技术介绍
0、专利技术背景
1、化学成分确定的二肽通常用于替代生物制药生产中使用的细胞培养基中难以配制的氨基酸。二肽的形成增加了谷氨酰胺的稳定性以及酪氨酸和胱氨酸的溶解度。众所周知的例子是丙氨酰-谷氨酰胺、甘氨酰-谷氨酰胺、甘氨酰-酪氨酸、丙氨酰-酪氨酸和n,n'-二-丙氨酰-胱氨酸。它们被有效地用作营养物，并且对其吸收和代谢进行了详细研究(sánchez-kopper et al.amb expr(2016)6:48,verhagen et al.eng life sci.(2020)；1-11)。
2、wo 2011/133902公开了包含二肽的细胞培养基，其中所述二肽包含在水中具有低溶解度的氨基酸，在这种情况下为酪氨酸和半胱氨酸。半胱氨酸不仅在水中的溶解度低，而且由于反应性巯基基团的存在而不稳定。此外，使用较高浓度(例如10mm)的半胱氨酸会降低细胞活力。作者发现，通过在二肽中掺入酪氨酸和半胱氨酸，可以改善氨基酸的溶解度和稳定性问题。更高的稳定性和溶解度使得能够配制化学成分确定的高浓度培养基，这是运行强化和高产工业细胞培养方法所需的。
3、微量元素是所有动物和人类
4、对于用于体外培养动物或人类细胞的细胞培养基的配制来说，例如在生物制药、基于细胞培养的单克隆抗体生产、病毒疫苗或细胞疗法的背景下，这是一个众所周知的挑战。在充足的供应和毒性作用之间取得平衡可能很困难，特别是在需要化学成分明确、无血清甚至无蛋白质的培养基时。微量金属通常作为其他培养基成分(例如氨基酸)的杂质存在，这一事实使情况变得更加复杂。
5、经典基础培养基配方中定义的微量元素浓度在不同配方之间的相对较宽的浓度范围内变化。例如，锌和铜的浓度在低纳摩尔至低微摩尔范围内，但大部分通常上是通过血清引入，其含有10至30μm的这些微量元素(vargas arigony et al.biomed researchinternational(2013)article id 597282)。
6、当需要无血清、化学成分确定的培养基来提高现代生物制药细胞培养的安全性、一致性和性能时，这些微量元素必须以化学成分确定的形式添加，这意味着无机盐。
7、关于化学成分确定的生物生产培养基中微量金属含量的已发表数据有限。然而，研究表明，添加足够量的铜和锌对于支持生长、产物形成很重要，并且对初级代谢(例如乳酸消耗)有直接影响。它还被证明对产品质量具有积极影响。许多出版物中对浓度效应进行了系统研究。对于铜，描述了0.05至100μm之间的浓度(yuk et al.biotechnol.prog.(2015),31；1:226-238；chaderjian et al.biotechnol.prog.(2005),21:550-553)。对于锌，描述了3至150μm之间的浓度(roca et al.cytotechnoloy(2019)71:915-924；grahamet al.applied microbiology and biotechnology(2020),104:1097-1108)。在所有情况下，都可以证明添加的有益效果，但高浓度会导致性能或毒性降低。
8、文献中有证据表明，微量金属的毒性作用是由与其他培养基成分的氧化还原反应引起的，所述反应导致形成活性氧种类(ros)，其在较高浓度下变得有毒(keenan et al.,in vitro cellular&developmental biology-animal(2018)54:555–558；graham et al.,biotechnology and bioengineering.2019；116:3446–3456)。
9、氨基酸l-半胱氨酸参与与金属离子的氧化还原反应并有助于ros的形成。在这些反应中，l-半胱氨酸被氧化成二硫键形式的l-胱氨酸。这在文献中对l-半胱氨酸存在下的cu2+离子进行了描述。
10、由于细胞培养基中需要微量金属和足够量的半胱氨酸源以最大化细胞培养物的生产力，因此仍然需要改进细胞培养基配方以确保足够的微量金属供应而无毒性。还需要提供足够的半胱氨酸当量，同时向细胞提供足够的微量金属。因此，本专利技术的一个目标是提供一种细胞培养基，其提供半胱氨酸源并确保微量金属的供应，但同时具有降低的微量金属和半胱氨酸毒性。
技术实现思路
0、专利技术概述
1、本专利技术解决了上述缺点。本专利技术由所附独立权利要求的术语限定。本专利技术的优选实施方案由从属权利要求限定。
2、令人惊奇地发现，向细胞培养基中添加二肽可降低金属离子的毒性。此外，发现添加二肽可降低l-半胱氨酸诱导的金属毒性。最后，发现用胱氨酸二肽替代l-半胱氨酸可以完全抑制l-半胱氨酸诱导的金属毒性，并且与各自的对照相比，细胞活力实际上增加了。
3、根据本专利技术的组合物包含至少一种由两个氨基酸组成的二肽和至少一种微量金属离子，所述氨基酸是天然氨基酸并且所述氨基酸中的至少一种是半胱氨酸(cys)，其中二肽与微量金属离子的摩尔比在10000至20之间。
4、根据本专利技术的组合物还可以是化妆品、营养补充剂、用于临床营养的营养液、或细胞或组织培养基(基础培养基、补料培养基或灌注培养基)的组成部分。
5、本专利技术进一步涉及本专利技术的培养基用于培养细胞，优选植物细胞、动物细胞或哺乳动物细胞的用途。
6、本专利技术的另一方面涉及一种制造细胞培养产物的方法，包括以下步骤：(i)提供能够产生所述细胞培养产物的细胞；(ii)使所述细胞与根据本专利技术的培养基接触；(iii)从所述培养基或从所述细胞获得所述细胞培养产物。
7、在下面的专利技术详述中进一步详细描述本专利技术的优选实施方案。
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1.一种组合物，所述组合物包含
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述二肽与所述微量金属离子的摩尔比为5000至20，优选为1000至20。
3.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述微量金属选自铁、锂、锌、铜、铬、镍、钴、钒、钼、锰，所述微量金属离子优选为铜离子。
4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述二肽浓度为0.1至200mM，优选0.2至20mM，最优选0.5至10mM，并且所述微量金属离子浓度为0.1至400μM，优选0.2至100μM，最优选0.5至20μM。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述二肽是Xxx-Cys或Cys-Xxx，其中Xxx是天然氨基酸，所述二肽优选是Ala-Cys、Cys-Ala、Lys-Cys或Cys-Lys。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述二肽是Xxx-Cys或Cys-Xxx并且是氧化和二聚化形式。
7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其进一步包含游离半胱氨酸。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中
9.一种化妆品、营养补充剂、用于临床营养的营养液，其包含根据前述权利要求中任一项所述的组合物。
10.一种细胞培养基，所述细胞培养基包含根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，所述培养基还包含至少一种碳水化合物，和/或至少一种另外的游离氨基酸，和/或至少一种无机盐，和/或缓冲剂和/或至少一种维生素。
11.根据权利要求10所述的培养基，其中所述培养基为液体形式、凝胶、粉末、颗粒、丸粒形式或片剂形式。
12.根据权利要求10或11中任一项所述的培养基，其中相对于使用中的培养基的浓度，所述培养基是2至100倍浓缩的形式，优选2倍、3倍、3.33倍、4倍、5倍或10倍浓缩形式。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的培养基用于培养细胞的用途，优选作为水性储备溶液或补料溶液用于培养细胞的用途。
14.权利要求13的用途，其中所述细胞选自由CHO细胞、COS细胞、VERO细胞、BHK细胞、HEK细胞、HELA细胞、AE-1细胞、NS0细胞、昆虫细胞、成纤维细胞、肌细胞、神经细胞、干细胞、皮肤细胞、内皮细胞、免疫细胞如NK细胞或T细胞，和杂交瘤细胞组成的组。
15.一种制造细胞培养产品的方法，所述方法包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种组合物，所述组合物包含
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述二肽与所述微量金属离子的摩尔比为5000至20，优选为1000至20。
3.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述微量金属选自铁、锂、锌、铜、铬、镍、钴、钒、钼、锰，所述微量金属离子优选为铜离子。
4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述二肽浓度为0.1至200mm，优选0.2至20mm，最优选0.5至10mm，并且所述微量金属离子浓度为0.1至400μm，优选0.2至100μm，最优选0.5至20μm。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述二肽是xxx-cys或cys-xxx，其中xxx是天然氨基酸，所述二肽优选是ala-cys、cys-ala、lys-cys或cys-lys。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述二肽是xxx-cys或cys-xxx并且是氧化和二聚化形式。
7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其进一步包含游离半胱氨酸。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述二肽结合的半胱氨酸与所述游离半胱氨酸的摩尔比为约0.1至10，优选为约0.2至4，最优选为约0.5至2。
【专利技术属性】
技术研发人员：M·席林，A·贝内迪克特，AK·库恩，C·凯斯勒，M·戈麦斯，S·兰德尔，
申请(专利权)人：赢创运营有限公司，
类型：发明
国别省市：
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