一种L-异亮氨酸生产菌株及其构建方法与应用技术

技术编号：41134453 阅读：19 留言：0更新日期：2024-04-30 18:05

本发明专利技术提供了一种L‑异亮氨酸生产菌株及其构建方法与应用，所述菌株具有良好的L‑异亮氨酸合成能力，性能稳定，产酸效率高，通过缺失livJ、rhtA、tdh、ilvE、ilvBN（eco）基因，上调pntAB、thrA<supgt;fbr</supgt;BC、ilvD、ilvA<supgt;fbr</supgt;、ilvIH<supgt;fbr</supgt;、ilvC、tdcB、ygaZH、lrp、avtA基因的转录水平，异源表达来源于B.subtilis 168的ald、gdh基因、来源于Corynebacterium glutamicum K051的ilvBN<supgt;fbr</supgt;（cgl）、cysK基因，有效提高了L‑异亮氨酸合成效率，应用于发酵生产L‑异亮氨酸，具有广泛的工业应用前景。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物技术与发酵工程，尤其是一种l-异亮氨酸生产菌株及其构建方法与应用。

技术介绍

1、l-异亮氨酸(c6h13no2)化学名称为2-氨基-3-甲基丁酸，属于支链氨基酸，l-缬氨酸是组成蛋白质的20种氨基酸之一，是人体必需的8种氨基酸和生糖氨基酸，它与其他两种高浓度氨基酸（缬氨酸和亮氨酸）一起工作促进身体正常生长，修复组织，调节血糖，并提供需要的能量。l-异亮氨酸已广泛应用于医药、食品及保健品、动物饲料和化妆品的制造等，尤其是在医学研究和治疗中的作用，日益受到重视。

2、目前，l-异亮氨酸的生产有蛋白质水解法、化学合成法以及生物发酵法三条主要途径。其中，蛋白质水解法存在着污染严重、得率低、产品杂质较多、纯度低、晶型差等缺点。化学合成法由于原料数量和来源较少，合成步骤相对复杂。而发酵法具有成本低，控制简单等优点，在l-异亮氨酸的大规模工业化生产中占有很大的优势，是目前l-异亮氨酸工业化生产的主要方法。

3、目前，微生物发酵技术已被成功地应用于有应用前景的代谢产物如醇、有机酸和氨基酸等物质的工业化生产中。目前主要采用谷氨酸棒杆菌（corynebacteriumglutamicum）发酵法工业化生产l-异亮氨酸，然而该类菌株发酵周期较长。大肠杆菌具有遗传背景清晰、技术操作简单、代时短等优势，因而被广泛应用于l-苏氨酸、l-色氨酸及l-苯丙氨酸等氨基酸的生产，但传统的异亮氨酸生产菌株分子学改造复杂且不稳定，因此目前急需一种高效、方便、稳定的工程菌株。

技术实现思路</p>

1、本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种l-异亮氨酸生产菌株。

2、本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述l-异亮氨酸生产菌株的构建方法。

3、本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述l-异亮氨酸生产菌株的应用。

4、为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：

5、一种人工操纵子，为avta-ald人工操纵子，包括avta、ald基因，具体为：

6、（1）操纵子基因顺序为trc启动子、rbs、avta、ald、rrnb t1终止子；

7、（2）trc启动子、rbs核糖结合位点与avta基因首尾直接相连；

8、（3）avta、ald基因使用linker基因相连，所述linker基因的核苷酸序列如序列表seq id no.3所示；

9、（4）ald、rrnb t1终止子首尾直接相连。

10、上述人工操纵子的构建方法，由同一个trc启动子与rbs核糖体结合位点控制操纵子开始转录，由同一个rrnb t1终止子控制操纵子终止转录，通过优化基因连接方式与基因在操纵子中的存在位置获得。

11、一种l-异亮氨酸生产菌株，为基因组上具有上述avta-ald人工操纵子所有特征的菌株xx16，所述菌株以e.coli w3110作为底盘菌株，缺失了livj、rhta、tdh、ilve、ilvbn（eco）基因，上调了pntab、thrafbrbc、ilvd、ilvafbr、ilvihfbr、ilvc、tdcb、ygazh、lrp、avta基因的转录水平，异源表达了来源于b.subtilis 168的ald、gdh基因、来源于corynebacterium glutamicum k051的ilvbnfbr（cgl）、cysk基因。

12、优选的，上述l-异亮氨酸生产菌株，是由下述方法改造获得的：以e.coli w3110作为底盘菌株，敲除了菌株基因组上的livj、rhta、tdh、ilve、ilvbn（eco）基因；利用trc启动子强化了pntab基因转录，并整合到基因组yjiv假基因位点；利用trc启动子强化了苏氨酸操纵子thrafbrbc基因转录，并整合到基因组ycgh假基因位点且双拷贝至yeep假基因位点；利用trc启动子强化了ilvd基因转录，并整合到基因组yciq假基因位点；利用trc启动子强化了ilvafbr基因转录，并整合到基因组yeel假基因位点；利用trc启动子强化了ilvihfbr基因转录，并整合到基因组mbha假基因位点；利用trc启动子强化了ilvc基因转录，并整合到基因组ycdn假基因位点；利用trc启动子强化了tdcb基因转录，并整合到基因组ygay假基因位点；利用trc启动子强化了ygazh基因转录，并整合到基因组ylbe假基因位点；利用trc启动子强化了lrp基因转录，并整合到基因组ilvg假基因位点；利用trc启动子强化了avta基因和来源于b.subtilis 168的ald基因转录，并整合到基因组yjgx假基因位点形成avta-ald人工操纵子；利用trc启动子强化了来源于corynebacterium glutamicum k051的ilvbnfbr（cgl）基因转录，并整合到基因组rhta假基因位点；利用trc启动子强化了来源于corynebacterium glutamicum k051的cysk基因转录，并整合到基因组tdh假基因位点；利用trc启动子强化了来源于b.subtilis 168的gdh基因转录，并整合到基因组ilve假基因位点。

13、上述thrafbrbc基因进行了点突变，即第1034位碱基由c变为t，导致第345位氨基酸残基由丝氨酸变为苯丙氨酸；上述ilvafbr基因进行了点突变，即第1339位碱基由 c 变为t,第1341位碱基由g 变为t, 第1351位碱基由 c 变为g, 第1352位碱基由t变为c，导致第447位氨基酸残基由亮氨酸变为苯丙氨酸，第451为氨基酸残基由亮氨酸变为丙氨酸；上述ilvihfbr基因进行了点突变，即第41位碱基由g变为a，第50位碱基由c变为t，导致第14位氨基酸残基由甘氨酸变为天冬氨酸，第17位氨基酸残基由丝氨酸变为苯丙氨酸；上述ilvbnfbr（cgl）经过了点突变，即第526位碱基由c变为t，第1278位碱基由c变为a，导致第176位氨基酸残基由脯氨酸变为丝氨酸，第426位氨基酸残基由天冬氨酸变为谷氨酸。

14、优选的，上述l-异亮氨酸生产菌株，所述trc启动子的核苷酸序列如序列表seq idno.1所示；rbs核糖体结合位点的核苷酸序列如序列表seq id no.2所示；livj基因的核苷酸序列如序列表seq id no.4所示；ilvbn（eco）基因的核苷酸序列如序列表seq id no.5所示；rhta基因的核苷酸序列如序列表seq id no.6所示；tdh基因的核苷酸序列如序列表seqid no.7所示；ilve基因的核苷酸序列如序列表seq id no.8所示；pntab基因簇的核苷酸序列如序列表seq id no.9所示；thrafbrbc基因簇的核苷酸序列如序列表seq id no.10所示；ilvd基因的核苷酸序列如序列表seq id no.11所示；ilvafbr基因的核苷酸序列如序列表seq id no.12所示；ilvihfbr基因簇的核苷酸序列如序列表seq id no本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种人工操纵子，其特征在于：为avtA-ald人工操纵子，包括avtA、ald基因，具体为：

2.一种L-异亮氨酸生产菌株，其特征在于：为基因组上具有权利要求1所述人工操纵子所有特征的菌株XX16，所述菌株以E.coli W3110作为底盘菌株，缺失了livJ、rhtA、tdh、ilvE、ilvBN（eco）基因，上调了pntAB、thrAfbrBC、ilvD、ilvAfbr、ilvIHfbr、ilvC、tdcB、ygaZH、lrp、avtA基因的转录水平，异源表达了来源于B.subtilis 168的ald、gdh基因、来源于Corynebacterium glutamicum K051的ilvBNfbr（cgl）、cysK基因。

3.根据权利要求2所述的L-异亮氨酸生产菌株，其特征在于：是由下述方法改造获得的：以E.coli W3110作为底盘菌株，敲除了菌株基因组上的livJ、rhtA、tdh、ilvE、ilvBN（eco）基因；利用trc启动子强化了pntAB基因转录，并整合到基因组yjiV假基因位点；利用trc启动子强化了苏氨酸操纵子thrA

4.根据权利要求3所述的L-异亮氨酸生产菌株，其特征在于：所述trc启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；RBS核糖体结合位点的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；livJ基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示；IlvBN（eco）基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示；rhtA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示；tdh基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示；ilvE基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示；pntAB基因簇的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示；ThrAfbrBC基因簇的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.10所示；ilvD基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.11所示；ilvAfbr基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.12所示；ilvIHfbr基因簇的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.13所示；ilvC基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.14所示；tdcB基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.15所示；ygaZH基因簇的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.16所示；lrp基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.17所示；avtA基因的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.18所示；ald基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.19所示；IlvBNfbr（cgl）基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.20所示；cysK基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.21所示；gdh基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.22所示。

5.根据权利要求3所述的L-异亮氨酸生产菌株，其特征在于：E.coli W3110为E.coliW3110 ATCC 273250。

6.权利要求2-5之一所述L-异亮氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于：在出发菌株E.coli W3110基础上进行定向改造，具体步骤分为如下3个模块：

7.权利要求2-5之一所述L-异亮氨酸生产菌株在发酵生产L-异亮氨酸方面的应...

【技术特征摘要】

1.一种人工操纵子，其特征在于：为avta-ald人工操纵子，包括avta、ald基因，具体为：

2.一种l-异亮氨酸生产菌株，其特征在于：为基因组上具有权利要求1所述人工操纵子所有特征的菌株xx16，所述菌株以e.coli w3110作为底盘菌株，缺失了livj、rhta、tdh、ilve、ilvbn（eco）基因，上调了pntab、thrafbrbc、ilvd、ilvafbr、ilvihfbr、ilvc、tdcb、ygazh、lrp、avta基因的转录水平，异源表达了来源于b.subtilis 168的ald、gdh基因、来源于corynebacterium glutamicum k051的ilvbnfbr（cgl）、cysk基因。

3.根据权利要求2所述的l-异亮氨酸生产菌株，其特征在于：是由下述方法改造获得的：以e.coli w3110作为底盘菌株，敲除了菌株基因组上的livj、rhta、tdh、ilve、ilvbn（eco）基因；利用trc启动子强化了pntab基因转录，并整合到基因组yjiv假基因位点；利用trc启动子强化了苏氨酸操纵子thrafbrbc基因转录，并整合到基因组ycgh假基因位点且双拷贝至yeep假基因位点；利用trc启动子强化了ilvd基因转录，并整合到基因组yciq假基因位点；利用trc启动子强化了ilvafbr基因转录，并整合到基因组yeel假基因位点；利用trc启动子强化了ilvihfbr基因转录，并整合到基因组mbha假基因位点；利用trc启动子强化了ilvc基因转录，并整合到基因组ycdn假基因位点；利用trc启动子强化了tdcb基因转录，并整合到基因组ygay假基因位点；利用trc启动子强化了ygazh基因转录，并整合到基因组ylbe假基因位点；利用trc启动子强化了lrp基因转录，并整合到基因组ilvg假基因位点；利用trc启动子强化了avta基因和来源于b.subtilis 168的ald基因转录，并整合到基因组yjgx假基因位点形成avta-ald人工操纵子；利用trc启动子强化了来源于corynebacteriumglutamicum k051的ilvbnfbr（cgl）基因转录，并整合到基因组rhta假基因位点；利用trc启动子强化了来源于corynebacterium glutamicum k051的cysk基因转录，并整合到基因组tdh假基因位点；利用trc启动子强化了来源于b.subtilis 168的gdh基因转录，并整合到基因组ilve假基因位点。

4.根据权利要求3所述的l-异亮氨酸生产菌株，其特征在于：所述trc启动子的核苷酸序列如序列表seq id no.1所示；rbs核糖体结合位点的核苷酸序列如序列表seq id no.2所示；livj基因的核苷酸序列如序列表seq id no.4所示；ilvbn（e...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐庆阳，魏翔，刘样豪，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：

全部详细技术资料下载我是这个专利的主人