【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，尤其是涉及一种羧酸酯酶突变体及其制备方法与应用。
技术介绍
1、(s)-3-环己烯-1-甲酸(cas号：5708-19-0)，是口服抗凝药依度沙班的关键中间体。以往的报道中，化学法和酶法拆分外消旋酯或者酸是合成光学纯环己烯甲酸的重要方法。在化学diels-alder反应是合成(s)-3-环己烯-1-甲酸的主要途径，但是该方法反应条件严苛，步骤非常繁琐，至少需要六次重结晶才能得到光学纯的(s)-3-环己烯-1-甲酸，拆分收率仅20％左右。另外，化学拆分中会用到大量的有机试剂，造成环境污染，经济型很低。
2、生物催化具有绿色、环保、经济型高的优势，可以弥补生产中有机试剂的使用。目前，现有的商业化酶包括猪肝酯酶(ple)，马肝酯酶(hle)和猪胰脂肪酶(ppl)可以拆分3-环己烯-1-羧酸甲酯，但是这几种动物来源的商品酶价格昂贵、批次差异大，难以实现工业化生产。除此之外，文献中也报道过一些羧酸酯酶，包括acest1(bioresour technol，2020，317，123984)，accarest3(org lett，2021，23，3043-3047)，和bioh(biosci biotechnolbiochem，2019，83，1263-1269)，这些酶存在对应选择性不够高，结果仅限于实验室条件下等不足，难以实现大规模生产。
3、因此，针对外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯的拆分，迫切需要一种高催化活性和高选择性的生物催化剂，以满足工业化生产的需求。
4、有鉴于此，特提
技术实现思路
1、本专利技术的目的之一在于提供一种羧酸酯酶突变体，以解决现有技术中存在应用于拆分3-环己烯-1-羧酸甲酯的升温催化剂的催化活性低和选择性低的问题。
2、本专利技术的目的之二在于提供一种编码上述的羧酸酯酶突变体的多核苷酸。
3、本专利技术的目的之三在于提供一种重组载体。
4、本专利技术的目的之四在于提供一种重组细胞。
5、本专利技术的目的之五在于提供一种构建上述的重组细胞的方法。
6、本专利技术的目的之六在于提供一种羧酸酯酶突变体的制备方法。
7、本专利技术的目的之七在于提供上述的羧酸酯酶突变体或应用上述的制备方法制备的羧酸酯酶突变体在制备(s)-3-环己烯-1-甲酸中的应用。
8、本专利技术的目的之八在于提供一种(s)-3-环己烯-1-甲酸的制备方法。
9、为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：
10、第一方面，本专利技术提供了一种羧酸酯酶突变体，所述羧酸酯酶突变体包括在seqid no.1所示氨基酸序列上发生如下突变：第180位异亮氨酸替换为亮氨酸、第206位脯氨酸替换为丙氨酸和第282位丝氨酸替换为缬氨酸。
11、进一步的，所述羧酸酯酶突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示。
12、第二方面，本专利技术提供了一种编码上述的羧酸酯酶突变体的多核苷酸；
13、优选地，所述多核苷酸的核苷酸序列如seq id no.3所示。
14、第三方面，本专利技术提供了一种重组载体，所述重组载体携带上述的核苷酸序列；
15、优选地，所述重组载体为pet28a(+)、pet21a(+)或pet21b(+)；
16、优选地，所述重组载体含有t7启动子。
17、第四方面，本专利技术提供了一种重组细胞，所述重组细胞表达上述的羧酸酯酶突变体，或携带上述的核苷酸序列，或携带上述的重组载体。
18、第五方面，本专利技术提供了一种构建上述的重组细胞的方法，包括以下步骤：将上述的重组载体转化至宿主菌中，得到重组细胞；
19、优选地，所述宿主菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或者酿酒酵母。
20、第六方面，本专利技术提供了一种羧酸酯酶突变体的制备方法，包括以下步骤：将上述的重组细胞或应用上述的方法构建的重组细胞进行培养，得到含有胞内表达重组载体的菌体；破碎所述菌体得到所述羧酸酯酶突变体；
21、优选地，还包括对得到的羧酸酯酶突变体进行分离纯化的步骤。
22、第七方面，本专利技术提供了如上述的羧酸酯酶突变体或应用上述的制备方法制备的羧酸酯酶突变体在制备(s)-3-环己烯-1-甲酸中的应用。
23、第八方面，本专利技术提供了一种(s)-3-环己烯-1-甲酸的制备方法，包括以下步骤：将上述的羧酸酯酶突变体、缓冲液和外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯混合均匀，进行催化反应，反应产物经纯化得到(s)-3-环己烯-1-甲酸；
24、进一步的，所述催化反应的温度为25～40℃，优选为28～35℃；
25、所述催化反应的时间为1～6h，优选为3～6h；
26、所述催化反应的ph为6～9，优选ph为6～7；
27、优选地，所述外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯的质量浓度为50g/l～140g/l，优选为100g/l～140g/l；
28、优选地，所述羧酸酯酶突变体的用量为1g/l～20g/l，优选为5g/l～10g/l；
29、优选地，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、tris-hci或naoh-甘氨酸溶液；
30、优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；
31、优选地，所述磷酸盐缓冲液中磷酸盐的摩尔浓度为30mm～100mm；
32、优选地，所述磷酸盐包括磷酸二氢钠和磷酸氢二钠。
33、本专利技术提供的羧酸酯酶突变体，在如seq id no.1所示的氨基酸序列上，选择i180、p206和s282位点作为进行改造的位点，得到羧酸酯酶突变体，显著提高了其选择性拆分3-环己烯-1-羧酸甲酯制备(s)-3-环己烯-1-甲酸的活性，光学纯度可达99.2％以上。得到的羧酸酯酶突变体可在细胞上清中可溶性表达，可通过微生物发酵进行大规模生产，反应条件温和，操作过程简便，更适用于工业生产。
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1.一种羧酸酯酶突变体，其特征在于，所述羧酸酯酶突变体包括在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列上发生如下突变：第180位异亮氨酸替换为亮氨酸、第206位脯氨酸替换为丙氨酸和第282位丝氨酸替换为缬氨酸。
2.根据权利要求1所述的羧酸酯酶突变体，其特征在于，所述羧酸酯酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.编码权利要求1或2所述的羧酸酯酶突变体的多核苷酸；
4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体携带权利要求3所述的核苷酸序列；
5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞表达权利要求1或2所述的羧酸酯酶突变体，或者携带权利要求3所述的核苷酸序列，或携带权利要求4所述的重组载体。
6.一种构建权利要求5所述的重组细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求4所述的重组载体转化至宿主菌中，得到重组细胞；
7.一种羧酸酯酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求5所述的重组细胞或应用权利要求6所述的方法构建的重组细胞进行培养，得到含有胞内表达重组载体的菌体；破碎所述菌体得到所述羧
8.如权利要求1或2所述的羧酸酯酶突变体或应用权利要求7所述的制备方法制备的羧酸酯酶突变体在制备(S)-3-环己烯-1-甲酸中的应用。
9.一种(S)-3-环己烯-1-甲酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1或2所述的羧酸酯酶突变体、缓冲液和外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯混合均匀，进行催化反应，反应产物经纯化得到(S)-3-环己烯-1-甲酸。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述催化反应的温度为25～40℃，优选为28～35℃；
...【技术特征摘要】
1.一种羧酸酯酶突变体，其特征在于，所述羧酸酯酶突变体包括在seq id no.1所示氨基酸序列上发生如下突变：第180位异亮氨酸替换为亮氨酸、第206位脯氨酸替换为丙氨酸和第282位丝氨酸替换为缬氨酸。
2.根据权利要求1所述的羧酸酯酶突变体，其特征在于，所述羧酸酯酶突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示。
3.编码权利要求1或2所述的羧酸酯酶突变体的多核苷酸；
4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体携带权利要求3所述的核苷酸序列；
5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞表达权利要求1或2所述的羧酸酯酶突变体，或者携带权利要求3所述的核苷酸序列，或携带权利要求4所述的重组载体。
6.一种构建权利要求5所述的重组细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求4所述的重...
【专利技术属性】
技术研发人员：席道义，徐皓然，张峻华，户超群，
申请(专利权)人：国药国际医药科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：
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