【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物领域，尤其涉及一种dna链置换反应介导的时序性荧光编码的高维度成像标签及其应用。
技术介绍
1、自然界复杂万千的生命体中，每一个细胞都不是一座孤岛，它们存在于特定的组织器官中、行使着各自独特的功能，并且在其生命周期内与其周围环境相互作用、相互影响1。一个典型的组织微环境中包含很多执行特定功能的细胞，如起辅助和杀伤作用的t细胞、起免疫应答作用的b细胞、起杀伤作用的nk细胞、起抗原递呈作用的树突状细胞和起吞噬作用的巨噬细胞等，除了细胞以外，复杂的组织微环境中还存在细胞外基质，包裹有成纤维细胞，贯穿着许多血管和淋巴管等。因此，在空间层面全面探讨组织微环境中的细胞机制和生物学过程至关重要。
2、空间蛋白成像技术使用抗体、多肽、适配体等试剂靶向组织微环境，通过检测试剂上修饰的酶、荧光、金属或dna序列等信息进行成像和定量。其中，基于酶促色素沉积的免疫组织化学技术(简称免疫组化)是最经典的成像手段，该技术利用酶作为标记物，并采用底物被分解后的显色反应显示抗原抗体的结合与否，染色结果用普通光学显微镜的明场模式即可观察2,3。然而，肉眼可分辨的不同颜色在叠加之后会产生新的颜色(例如黄色与蓝色的靶标重合后会变成绿色)；浅颜色与深颜色的叠加会导致前者被后者的深度所覆盖4；并且多种颜色的叠加可能使某些区域不透光，影响光学成像5。以上这些限制使得免疫组化一次只能成像2-3个且定位不同的靶标6。
3、荧光具有独特的激发波长和发射波长，即便定位重叠也可以被各自独特的荧光通道所检测，因此基于荧光团为检测信号的免疫荧光
4、为了进一步提高荧光成像的数量，研究者尝试通过反复迭代“染色-洗脱-再染色”步骤的方式，在一张片子上按照一定顺序成像不同的靶标，最后将所得图片叠加，赋予不同靶标以伪彩，绘制成完整的多重靶标图像，上述过程被称为“迭代荧光成像”，本质是多次免疫荧光结果的叠加。由于每次成像都有f种荧光出现的可能，迭代n次则可成像f×n种蛋白，随着成像次数的增加，成像的蛋白数量会逐步增多，理论上能成像的蛋白数量无上限。在“染色-洗脱-再染色”的迭代过程中，通过热、微波等方式与化学试剂联用将抗体移除是“洗脱信号”最直接的方式。在一项新的研究中，来自瑞士苏黎世大学的研究人员开发出一种分析细胞及其组分的新方法，即迭代间接免疫荧光成像(iterative indirectimmunofluorescence imaging,4i)。该技术利用0.5m l-甘氨酸、低ph及高盐离子的组合去除抗体，使得在从组织到细胞器的不同水平下同时观察至少40种蛋白13。由于每次都将抗体移除，因此上一轮实验所用抗体的种属不会影响下一轮实验，可以用二抗进行荧光成像，从而提高荧光强度。然而，因为抗原抗体识别是不可逆的共价结合，洗脱较为困难，对样本损害也较大。荧光淬灭是另一种迭代成像信号的洗脱方式，常见的淬灭方式包括通过强激发光淬灭的“光漂白”[如melc(multi-epitope ligand cartography)技术]14，通过化学试剂氧化荧光团的“化学漂白”[如ibex(iterative bleaching extends multiplexity)技术15和mxif(multiplexed fluorescence microscopy)技术16]，以及光和化学试剂同时作用的“联合漂白”[如cycif(cyclic immunofluorescence)技术17和t-cycif(tissue-basedcyclic immunofluorescence)18技术]。其中，光漂白引发的荧光淬灭的速度相对较慢；化学漂白利用化学氧化灭活荧光染料，需有氧化剂的参与，可能会对样本造成损害。正如前文所言，无论是光漂白还是抗体移除，对样本的损害都比较大。为了减小迭代过程对样本造成的损害，近些年研究者们尝试在抗体与荧光之间加入可以被温和切断的linker用于多重蛋白成像。郭嘉团队提出了一种以叠氮基为主的小分子量linker，该linker可以在30min被tcep切断，获得图像的信噪比高达20:1，作者证明了该技术在成像12个蛋白的可行性20。ralphweissleder课题组提出了一种基于对称反式环烯的切割速度更快的linker，该linker可以在数秒内被切断。并且由于切断是通过生物正交反应实现的，具有生物相容性，可以用于活细胞的蛋白成像。作者将该化学切断方式与迭代荧光成像技术结合，实现了对14种靶标的成像21。由于切断条件比较温和，对样本的损害比较少，可以获得质量更高的图像。此外，核酸之间通过氢键相互杂交，并且可以通过调节杂交环境改变杂交状态(高盐离子浓度、低ph条件下杂交；在低盐离子浓度、高ph条件下洗脱)，也是一种温和“切断”的linker，并且相比于前述linker更易获得，无需特殊的化学合成。目前，基于核酸杂交/去杂交原理发展来的迭代荧光成像技术包括codex(co-detection by indexing)22、dei(dna exchangeimaging)23、prism(probe-based imaging for sequential multiplexing)24等。由于抗体在与荧光链杂交之前不发光，在实际操作过程中可以通过“all-in-one”的方式将所有抗体都染上，以节省抗体孵育时间。得益于dna信号放大技术的成熟，利用dna杂交/去杂交进行迭代荧光成像不仅可以增加多重蛋白成像的数量，还可以进一步提高成像的灵敏度25-29。目前该技术可以稳定成像30～50种蛋白22，然而，随着成像数量的增加，实验对偶联dna的正交性要求越来越高，反应也愈发复杂。此外，该技术在抗体上偶联的dna尺寸相较于普通本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种DNA链置换反应介导的时序性荧光编码的高维度成像标签，其特征在于，所述标签为修饰有不同荧光基团和淬灭团的DNA片段按照一定顺序排列组合而成的杂交体，可随着DNA链置换反应的进行切换不同的颜色。
2.如权利要求1所述的成像标签，其特征在于，所述荧光基团的个数为2-10个，优选3-6个。
3.如权利要求1所述的成像标签，其特征在于，所述杂交体包括一条轨道DNA链、n条荧光DNA链和n条DNA置换链，轨道链和n条荧光链互补配对，依次加入的n条置换DNA链用于启动DNA链置换；所述每个荧光DNA链的5’端分别修饰了不同颜色的荧光基团，3’端包含一个用于启动链置换的游离序列及距离末端7-8nt的用于淬灭邻近荧光链的淬灭基团。
4.如权利要求1所述的成像标签，其特征在于，所述荧光DNA链和置换DNA链中的n分别为2-10，优选为3-6。
5.如权利要求1所述的成像标签，其特征在于，所述置换链上设有可将所置换的荧光链上的荧光基团淬灭的淬灭基团。
6.一种三色变化的DNA链置换反应介导的时序性荧光编码的高维度成像标签，其特征在于
7.根据权利要求6所述的成像标签，其特征在于，轨道链探针序列如SEQ ID NO.1所示；荧光链1探针序列如SEQ ID NO.2所示；荧光链2探针序列如SEQ ID NO.3所示；置换链1探针序列如SEQ ID NO.4所示；置换链2探针序列如SEQ ID NO.5所示；
8.根据权利要求1～7任一项所述的成像标签，
9.一种用于检测蛋白高维度成像的组合物，其特征在于，所述组合物由待检测蛋白的抗体与权利要求1～8任一项所述的DNA链置换反应接到的时序性荧光编码的高维度成像标签偶连而成；优选地，所述组合物用于检测待测蛋白质成像时所用检测仪器为荧光显微镜。
10.权利要求1～8任一项所述DNA链置换反应介导的时序性荧光编码的高维度成像标签以及权利要求8～9任一项的组合物在空间蛋白成像技术中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种dna链置换反应介导的时序性荧光编码的高维度成像标签，其特征在于，所述标签为修饰有不同荧光基团和淬灭团的dna片段按照一定顺序排列组合而成的杂交体，可随着dna链置换反应的进行切换不同的颜色。
2.如权利要求1所述的成像标签，其特征在于，所述荧光基团的个数为2-10个，优选3-6个。
3.如权利要求1所述的成像标签，其特征在于，所述杂交体包括一条轨道dna链、n条荧光dna链和n条dna置换链，轨道链和n条荧光链互补配对，依次加入的n条置换dna链用于启动dna链置换；所述每个荧光dna链的5’端分别修饰了不同颜色的荧光基团，3’端包含一个用于启动链置换的游离序列及距离末端7-8nt的用于淬灭邻近荧光链的淬灭基团。
4.如权利要求1所述的成像标签，其特征在于，所述荧光dna链和置换dna链中的n分别为2-10，优选为3-6。
5.如权利要求1所述的成像标签，其特征在于，所述置换链上设有可将所置换的荧光链上的荧光基团淬灭的淬灭基团。
6.一种三色变化的dna链置换反应介导的时序性荧光编码的高维度成像标签，其特征在于...
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