【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学及生物工程，特别涉及一种重组δami1蛋白的耻垢分枝杆菌及其构建方法。
技术介绍
1、结核分枝杆菌中的rv3717基因编码的ami1蛋白是一种参与细胞壁肽聚糖代谢的酰胺酶，敲除该基因能降低分枝杆菌在小鼠肺组织中的持留，是结核分枝杆菌致病因子之一；另一方面，该蛋白也是一种分泌型黏附素，其部分肽段具有良好免疫原性，在调节宿主免疫反应方面发挥一定作用。
2、结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，m.tb)是引起结核病的主要胞内致病菌，能够通过参与调控宿主免疫反应来维持自身存活。
3、结核病是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，m.tb)引起的传染性疾病，每年仍然有数百万的新发病例因结核病而死亡。目前，预防结核病的常用疫苗是由牛分枝杆菌制备的卡介苗(bcg)，其对儿童结核病具有保护作用，但在成年人、免疫力低下群体中保护效果较差。基于bcg疫苗的局限性，有效的结核病候选疫苗是全球研发的重点。
4、目前全球进入临床试验阶段的结核病候选疫苗主要包括病毒载体疫苗、重组bcg疫苗、分枝杆菌减毒株、亚单位疫苗以及分枝杆菌全细胞提取物疫苗。病毒载体疫苗mva85a主要利用病毒载体表达结核分枝杆菌黏附素ag85a，该疫苗能够被机体耐受并产生免疫原性，但对结核分枝杆菌感染保护率较低；结核分枝杆菌减毒株mtbvac是由敲除phop和fadd26基因的结核分枝杆菌改造而来；最新临床试验报告指出，mtbvac对婴幼儿和成年人均表现了持久激活
5、耻垢分枝杆菌(mycobacterium smegmatis mc2155，m.smeg)是一种非致病性分枝杆菌，通常被用作结核病的研究模型。相关研究表明，耻垢分枝杆菌具有潜在的免疫原性，并且在小鼠体内可诱导保护性免疫应答，促进干扰素-γ和白细胞介素-2的分泌，减少肺组织载菌量，在活分枝杆菌疫苗开发方面具有良好的应用前景。
技术实现思路
1、针对上述现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供了一种重组c-末端截短型突变ami1(δami1)蛋白的耻垢分枝杆菌及其构建方法，旨在以耻垢分枝杆菌为宿主菌，重组表达结核分枝杆菌免疫原性蛋白，从而增强其保护性免疫效应，同时又能调节宿主天然抗菌防御能力，以辅助增强宿主清除结核分枝杆菌的能力。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
3、本专利技术的第一方面提供了一种重组δami1蛋白的耻垢分枝杆菌的构建方法，包括以下步骤：
4、s1、构建rv3717-ntd大肠杆菌表达质粒：
5、根据结核分枝杆菌h37rv菌株基因组数据库中rv3717基因的核苷酸序列设计pcr引物，具体为rv3717-ntd，利用rv3717基因的上、下游引物扩增开放阅读框中58-543bp的核苷酸序列，在上游引物f1和下游引物r1的5’端分别引入bamhi和hindⅲ酶切位点，并加入保护性碱基，其中，引物的序列具体如下：
6、上游引物f1：5'cgggatccacccccgccatc 3'
7、下游引物r1：5'cccaagcttctacaggccgtcctggc3'
8、将阳性重组质粒进行dna序列测定，将测序结果与结核分枝杆菌h37rv基因组数据库中的rv3717序列进行分析比对，以保证重组质粒中基因序列的正确性；将bamhi和hindⅲ双酶切后的目的基因与pcold-sumo载体连接、转化，构建相应的rv3717-ntd重组大肠杆菌表达质粒，命名为pcold-sumo-rv3717-ntd重组质粒；
9、s2、构建rv3717-ntd重组分枝杆菌表达质粒：
10、首先，通过ndei和hindiii双酶切去除psum kan-mcs2-gfp质粒中gfp基因片段，获得psum-kan-mcs2/ndei+hindiii表达载体；
11、接着，以步骤s1获得的pcold-sumo-rv3717-ntd重组质粒为模板，进行pcr扩增，获得带有6*his-sumo标签的目的基因；
12、然后，在上游引物f2的5’端引入ndei酶切位点和在下游引物r2的3’端引入hindⅲ双酶切位点，其中，上游引物f2和下游引物r2具体如下：
13、上游引物f2：5'ggcatatgaattggagccacccgcag3'
14、下游引物r2：5'cccaagcttctacaggccgtcctggc 3'
15、将seq id no.1所示的6*his-sumo-rv3717-ntd基因片段进行pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收和纯化pcr扩增产物，目的基因与pmd18t载体连接，并进行连接产物的转化；
16、阳性重组质粒的目的基因序列进行比对后，进一步进行ndei和hindⅲ双酶切后，回收目的片段；
17、最后，将所得酶切回收的目的基因片段与酶切回收的psum-kan-mcs2载体片段进行连接，转化，构建得到seq id no.2所示的rv3717-ntd重组分枝杆菌表达质粒，命名为psum36-his-sumo-rv3717-ntd重组质粒；
18、s3、基于构建的psum36-his-sumo-rv3717-ntd重组质粒，利用电转化方式构建得到重组δami1蛋白的耻垢分枝杆菌，命名为rm.smeg/rv3717-ntd重组菌株。
19、本专利技术的第二方面在于提供了上述构建方法制得的重组δami1蛋白的耻垢分枝杆菌。
20、本专利技术的第三方面在于提供了上述重组δami1蛋白的耻垢分枝杆菌在制备活分枝杆菌疫苗中的应用。
21、本专利技术具备如下有益效果：
22、(1)本专利技术构建了rv3717-ntd重组大肠杆菌表达质粒，该重组质粒可以在分枝杆菌系统内高表达6*his-sumo融合δami1蛋白。本专利技术利用rm.smeg/rv3717-ntd重组菌株合成了δami1融合蛋白，并利用ni-nta亲和层析分离和纯化，得到了分子量为31kda的δami1融合蛋白。
23、(2)本专利技术构建了重组δami1蛋白的耻垢分枝杆菌菌株，命名为rm.smeg/rv3717-ntd重组菌株，该rm.smeg/rv3717-ntd重组菌株是过表达c-末端截短的ami1蛋白(δami1)的重组分枝杆菌，研究发现该rm.smeg/rv3717-ntd重组菌株具有促进igg2a分泌的作用，能够激活宿主lc3相关天然免疫效应，并且具有增强宿主细胞清除胞内病原体的作用。因此，本专利技术构建的重组δami1蛋白的耻垢分枝杆菌即rm.smeg/rv3717-ntd重组菌株具有良好的免疫原性和天然免疫激活效应。
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1.一种重组ΔAmi1蛋白的耻垢分枝杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的构建方法制得的重组ΔAmi1蛋白的耻垢分枝杆菌。
3.如权利要求2所述的重组ΔAmi1蛋白的耻垢分枝杆菌在制备活分枝杆菌疫苗中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种重组δami1蛋白的耻垢分枝杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的构建方法制得的重...
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