【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物发酵，具体涉及一种发酵生产透明质酸酶的方法。
技术介绍
1、透明质酸酶是一种内源性糖苷酶，可以降解透明质酸聚合物中的糖苷键。透明质酸酶于1929年被duran等首次发现，来源于哺乳动物睾丸提取物，当时被称为“扩散因子”，因为其对疫苗、染料、毒素等物质的扩散具有促进作用。
2、由于透明质酸酶分离纯化困难且对其功能的了解较少，导致透明质酸酶的研究长期处于相对停滞状态。近年来，透明质酸酶的研究已成为一个热点，其功能和性质被逐渐揭示，其应用，特别是在制药工业和临床医疗领域的应用被慢慢探明，目前降解透明质酸的方法主要有物理降解法（包括超声降解、γ-射线辐射、加热降解、高压均质降解）和化学降解法（包括酸水解、碱水解、氧化降解）及酶降解法。与物理和化学法相比，用透明质酸酶法制备低分子量或寡聚透明质酸，能更加特异性地降解化学键而不对其他分子基团产生影响，具有反应温和、重复性好、降解可控等优点，因此，挖掘更多新颖的透明质酸酶，以及更加深人地了解透明质酸酶的功能和性质具有重要的研究意义。
3、透明质酸酶广泛存在于真核生物和原核生物中，主要水解透明质酸，是一种重要的生理活性物质。根据透明质酸酶作用的底物特异性和催化机制，将其分为三类。第一类是来源于哺乳动物的透明质酸4-糖基水解酶家族，这类透明质酸酶（ec3.2.1.35）是具有水解和转糖苷活性的糖苷酶，通过水解透明质酸（ha）的β-1、4-糖苷键，产物以四糖为主；第二类为微生物透明质酸酶，这类透明质酸酶（ec4.2.2.1）通过β-消除反应裂解ha的β-糖苷
4、透明质酸酶是一类具有重要生理作用和应用价值的糖苷酶类，在医疗上，透明质酸酶被广泛应用于骨科、外科、眼科、内科、皮肤科、妇科等多个领域。由于透明质酸对组织中的透明质酸有解聚作用，导致透明质酸酶具有良好的促进药物扩散效果，降解人体组织的透明质酸以增加其通透性，促进注射液的扩散；还可用于制备有生物活性的低分子量糖胺寡糖；在工业生产方面，可用于降解动物皮革组织的糖胺聚糖，替代传统皮革制备工艺中石灰法，以降低环境污染。
5、本专利技术采用发酵法生产透明质酸酶，通过优化发酵条件，实现透明质酸酶的高效表达，进一步推动透明质酸酶在医疗和科研上的广泛应用。
技术实现思路
1、本专利技术通过利用酸水解酪蛋白代替胰蛋白胨（oxoid），利用fm905型酵母浸粉代替oxoid型酵母浸粉，优化发酵配方，得最佳发酵配方，采用本方法获得的透明质酸酶实现了透明质酸酶的高效表达，且该方法工艺简单，生产成本低，适合大规模工业化生产。
2、本专利技术是通过如下技术方案来实现的。
3、一种发酵生产透明质酸酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1）种子培养，步骤2）发酵培养，步骤3）离心，步骤4）盐析，步骤5）过滤，步骤6）超滤。
4、进一步地，所述方法包括如下步骤：
5、步骤1）种子培养：将透明质酸酶的生产菌种接入种子培养基中进行培养，得种子液；
6、步骤2）发酵培养：将步骤1）得到的种子液按1-5%的接种量接入发酵培养基进行发酵培养，得透明质酸酶发酵液；
7、步骤3）离心：将步骤2）得到的透明质酸酶发酵液离心，得透明质酸酶离心液；
8、步骤4）盐析：将步骤3）得到的透明质酸酶离心液中加入纯水，待完全溶解后，加入适量的珍珠岩，并用盐酸调节ph值至7.0，搅拌1~2小时，收集沉淀；
9、步骤5）过滤：将步骤4）得到的沉淀进行过滤，得透明质酸酶液；
10、步骤6）超滤：将步骤5）得到的透明质酸酶液采用超滤膜除杂，即得透明质酸酶。
11、优选地，所述种子培养基包括：蛋白胨1%，酵母浸粉（fm905）1%，葡萄糖1.5%，k2hpo4•3h2o1.5%，余量为水，质量百分比。
12、优选地，所述发酵培养基包括酸水解酪蛋白1.5%，酵母浸粉（fm905）0.5%，k2hpo4•3h2o 0.2%，mgs040.05%等。
13、优选地，所述步骤（2）中，发酵培养的条件为：
14、接种量为1~5%，溶氧控制在10~20%，ph为7~7.5、温度35°c，发酵24h。
15、实施方式
16、本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。为了进一步理解本专利技术，下面结合实施例对本专利技术进行详细说明。
17、实施例
18、一种发酵生产透明质酸酶的方法，其包括：
19、1、种子的活化、诱导以及优化：
20、1）本试验采用链霉菌atcc31394作为出发菌株；
21、2）将原始出发菌种通过活化、稀释，涂在适合细菌生长的培养基上；
22、3）将培养基器皿倒置放于32℃恒温箱中，培养后观察其生长情况；
23、4）器皿上长出的许多单个菌落，选取优良菌种，经分离后即为各种纯种菌株。
24、2、种子培养
25、将透明质酸酶的生产菌种接入种子培养基中进行培养24h，得种子液。
26、所述种子培养基包括：蛋白胨1%，酵母浸粉（oxoid）1%，葡萄糖1.5%，k2hpo4•3h2o1.5%等。
27、3、发酵培养
28、所述发酵培养基包括胰蛋白胨1.5%，酵母浸粉（oxoid）0.5%，k2hpo4•3h2o 0.2%，mgs040.05%。
29、将种子液按5%的接种量接入发酵培养基，控制溶氧120%，ph为7，在温度为32℃的条件下进行发酵培养24h，得透明质酸酶发酵液，经检测透明质酸酶的活性为9.86万u/ml。
30、实施例
31、一种发酵生产透明质酸酶的方法，其包括：
32、1、种子的活化、诱导以及优化：
33、1）本试验采用链霉菌atcc31394作为出发菌株；
34、2）将原始出发菌种通过活化、稀释，涂在适合细菌生长的培养基上；
35、3）将培养基器皿倒置放于32℃恒温箱中，培养后观察其生长情况；
36、4）器皿上长出的许多单个菌落，选取优良菌种，经分离后即为各种纯种菌株。
37、2、种子培养
38、将透明质酸酶的生产菌种接入种子培养基中进行培养24h，得种子液。
39、所述种子培养基包括：本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种发酵生产透明质酸酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1）种子培养，步骤2）发酵培养，步骤3）离心，步骤4）盐析，步骤5）过滤，步骤6）超滤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述种子培养基包括：蛋白胨1%，酵母浸粉（FM905）1%，葡萄糖1.5%，K2HPO4•3H2O1.5%。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括酸水解酪蛋白1.5%，酵母浸粉（FM905）0.5%，K2HPO4•3H2O 0.2%，MgS040.05%等。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，发酵培养的条件为：
【技术特征摘要】
1.一种发酵生产透明质酸酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1）种子培养，步骤2）发酵培养，步骤3）离心，步骤4）盐析，步骤5）过滤，步骤6）超滤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述种子培养基包括：蛋白胨1%，酵母浸粉（fm9...
【专利技术属性】
技术研发人员：李学朋，王飞，冯世红，崔小红，王奎智，
申请(专利权)人：新疆阜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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