【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及遗传育种，具体涉及一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化率的方法。
技术介绍
1、玉米是重要的粮食作物和经济作物，使用生物技术提高玉米的产量与品质具有重要意义。转基因技术、细胞工程和分子标记技术是玉米育种中常用的三种生物技术手段。转基因技术是借助dna重组技术，将优异的外源基因导入到玉米中，例如抗虫、抗除草剂、优质、抗逆、抗病和高产等多种性状，改变玉米原有的遗传特性，提高它的产量和品质。
2、玉米的遗传转化方法主要有农杆菌介导法、基因枪轰击法、电击法、peg法和花粉管通道法等，其中农杆菌介导法和基因枪轰击法为目前常用的转基因方法。农杆菌介导法是将目的基因插入到ti质粒的t-dna区，借助农杆菌的感染将外源基因整合到植物的基因组中，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌是植物转基因的天然转化载体系统，因此农杆菌介导法具有成功率高、效果好以及费用低的优点，但是t-dna可以在有染色体的任何区域插入，可能导致目的基因的插入失活。
3、良好的受体系统是玉米遗传转化研究的基础，是决定转化效率高低的关键因素，尽管目前用于玉米组织培养的外植体类型很多，如幼胚、成熟胚、雌雄幼穗、雄幼穗颖片、未成熟花序、茎节、幼苗芽顶分生组织及中胚轴等，但幼胚仍是最佳和使用最多的外植体。农杆菌介导玉米遗传转化所受影响因素很多，如菌液预处理、幼胚大小、愈伤组织状态、侵染培养基、侵染时间、共培养条件、乙酰丁香酮浓度等。
4、因此，遗传转化效率受多方面因素共同影响，寻求一种常规遗传转化率高的方法对玉米遗传育种意
技术实现思路
1、为寻求一种高效的遗传转化方法，本专利技术提供了一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化率的方法，本专利技术的方法显著促进了愈伤形成和提高gus基因表达，gus基因瞬时的平均表达为98.33％，还促进了遗传转化，转化率为12％以上。
2、本专利技术提供了一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化率的方法，将玉米幼胚依次于41℃～45℃热激处理、10000～15000rcf离心处理、农杆菌侵染后于盐浓度50％～100％的共培养培养基培养，然后转接到选择培养基选择培养获得愈伤组织，然后经过再生培养获得再生幼苗。
3、进一步地，具体包括如下步骤：
4、s1，将玉米幼胚用无菌侵染培养基清洗后在41℃～45℃下处理幼胚3～4min，冷却1～2min；
5、s2，将冷却后的玉米幼胚按照相对离心力10000～15000rcf转速，处理幼胚5～6min，去除侵染培养基；
6、s3，离心处理后的玉米幼胚中加入agl1农杆菌菌液，混匀后黑暗静置侵染10～15min；
7、s4，将侵染后玉米幼胚转移至盐浓度50％～100％的共培养培养基，于19～21℃下暗培养3天，然后将玉米幼胚转移至静息培养基中，于28℃暗培养6～9d；
8、s5，取s4中培养结束后的玉米幼胚切除胚根转至含有2.0～2.5mg/l双丙氨磷的选择培养基i上，28℃暗培养14～16d，初步获得存活的愈伤组织；
9、s6，将获得的愈伤组织转到含有5.0～6.0mg/l双丙氨磷的选择培养基ii上，28℃暗培养26～30d，获得抗性愈伤组织，然后将抗性愈伤组织转移至再生培养基中，26℃光照培养14～18d，获得再生幼苗。
10、进一步地，s2中，相对离心力为10000rcf转速。
11、进一步地，s4中，共培养培养基的盐浓度为50％。
12、进一步地，s1中，侵染培养基配方为：ms培养基基础盐4.3g，蔗糖68.5g，葡萄糖36g，l-脯氨酸0.7g，mes水合物0.5g，2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)1.5mg，乙酰丁香酮(as)19.6mg，1000×ms维生素溶液1ml(甘氨酸2g，维生素b1 0.5g，维生素b6 0.5g，烟酸0.05g)，ph值5.2。
13、进一步地，s3中，含有gus基因pfgc5941质粒的agl1农杆菌菌液制备过程为：将含有植物表达载体pfgc5941的农杆菌agl1在含50mg/l kana和含50mg/l rif的yep固体培养基上28℃条件下倒置培养2d，收集农杆菌菌落，并将其重悬于侵染培养基中摇菌20～30min，使其od600为0.4～0.6时，获得含有gus基因pfgc5941质粒的agl1农杆菌菌液。
14、进一步地，s4中，50％盐浓度的共培养培养基配方为：ms培养基基础盐2.15g，蔗糖30g，l-脯氨酸0.7g，mes水合物0.5g，水解酪蛋白0.1g，肌醇0.1g，l-半胱胺酸0.4g，二硫苏糖醇0.154g，乙酰丁香酮19.6mg，麦草畏3.5mg，硝酸银(agno3)0.85mg，1000×ms维生素溶液1ml(甘氨酸2g，维生素b1 0.5g，维生素b6 0.5g，烟酸0.05g)，琼脂8g，ph值5.8。
15、进一步地，s4中，静息培养基配方为：ms培养基基础盐4.3g，蔗糖30g，l-脯氨酸0.7g，mes水合物0.5g，水解酪蛋白0.1g，肌醇0.1g，麦草畏3.5mg，硝酸银0.85mg，1000×ms维生素溶液1ml(甘氨酸2g，维生素b1 0.5g，维生素b6 0.5g，烟酸0.05g)，头孢菌素(cefotaxime)0.25g，植物凝胶2.5g，ph值5.8。
16、进一步地，s4中，将侵染后玉米幼胚转移至共培养培养基后，还需要吸净培养基表面的菌液，将幼胚盾片朝上放置，不同幼胚间隔不少于3mm。
17、与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
18、1、本专利技术通过50％盐浓度处理促进了愈伤形成和提高了gus基因瞬时表达，gus基因瞬时的平均表达率为98.33％，促进了遗传转化，转化率达到12％以上。
19、本专利技术通过研究发现玉米幼胚热激预处理温度为43℃时，gus基因瞬时表达效率最好，且愈伤组织形成率为100％；10 000rcf处理玉米幼胚，对盾片区gus瞬时表达率和愈伤组织诱导形成率具有作用，能有效提高玉米幼胚的遗传转化效率；共培养培养基50％ ms盐浓度不影响愈伤组织的形成，同时gus瞬时表达情况较好；激素6-bap浓度对玉米愈伤组织发育和再生有明显的促进作用；硝酸银对玉米幼胚愈伤的形成有明显的抑制作用，但对再生成苗有显著的促进作用。
20、2、本专利技术中玉米抗性愈伤组织，经6-bap、cuso4和硝酸银处理，更容易更快获得幼苗，硝酸银处理对b104玉米幼胚愈伤组织有抑制作用，对成苗有显著的促进作用，最终选择1.7mg/l可加速b104玉米幼胚快速成苗，节约转化周期。
21、3、玉米幼胚热激预处理的最佳温度为43℃；利用10 000rcf离心力处理玉米幼胚；利用50％盐浓度的共培养培养基培养；筛选培养基ⅱ添加0.25mg/l6-bap、2.5mg/l cuso4、1.7mg/l agno3，可加快b104愈伤组织快速成苗，节约转化周期本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化率的方法，其特征在于，将玉米幼胚依次于41℃～45℃热激处理、10000～15000RCF离心处理、农杆菌侵染后于盐浓度50％～100％的共培养培养基培养，然后转接到选择培养基选择培养获得愈伤组织，然后经过再生培养获得再生幼苗。
2.根据权利要求1所述的提高农杆菌介导的玉米遗传转化率的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的提高农杆菌介导的玉米遗传转化率的方法，其特征在于，S1中，处理幼胚温度为43℃。
4.根据权利要求2所述的提高农杆菌介导的玉米遗传转化率的方法，其特征在于，S2中，相对离心力为10000RCF转速。
5.根据权利要求2所述的提高农杆菌介导的玉米遗传转化率的方法，其特征在于，S4中，共培养培养基的盐浓度为50％。
6.根据权利要求2所述的提高农杆菌介导的玉米遗传转化率的方法，其特征在于，S1中，侵染培养基配方为：MS培养基基础盐4.3g，蔗糖68.5g，葡萄糖36g，L-脯氨酸0.7g，MES水合物0.5g，2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1.
7.根据权利要求2所述的提高农杆菌介导的玉米遗传转化率的方法，其特征在于，S3中，AGL1农杆菌菌液制备过程为：将含有植物表达载体pFGC5941的农杆菌AGL1在含50mg/LKana和含50mg/L Rif的YEP固体培养基上28℃条件下倒置培养2d，收集农杆菌菌落，并将其重悬于侵染培养基中摇菌20～30min，使其OD600为0.4～0.6时，获得含有GUS基因PFGC5941质粒的AGL1农杆菌菌液。
8.根据权利要求2所述的提高农杆菌介导的玉米遗传转化率的方法，其特征在于，S4中，50％盐浓度的共培养培养基配方为：MS培养基基础盐2.15g，蔗糖30g，L-脯氨酸0.7g，MES水合物0.5g，水解酪蛋白0.1g，肌醇0.1g，L-半胱胺酸0.4g，二硫苏糖醇0.154g，乙酰丁香酮19.6mg，麦草畏3.5mg，硝酸银0.85mg，1000×MS维生素溶液1mL，琼脂8g，PH值5.8。
9.根据权利要求2所述的提高农杆菌介导的玉米遗传转化率的方法，其特征在于，S4中，静息培养基配方为：MS培养基基础盐4.3g，蔗糖30g，L-脯氨酸0.7g，MES水合物0.5g，水解酪蛋白0.1g，肌醇0.1g，麦草畏3.5mg，硝酸银0.85mg，1000×MS维生素溶液1mL，头孢菌素0.25g，植物凝胶2.5g，PH值5.8。
10.根据权利要求2所述的提高农杆菌介导的玉米遗传转化率的方法，其特征在于，S4中，将侵染后玉米幼胚转移至共培养培养基后，还需要吸净培养基表面的菌液，将幼胚盾片朝上放置，不同幼胚间隔不少于3mm。
...【技术特征摘要】
1.一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化率的方法，其特征在于，将玉米幼胚依次于41℃～45℃热激处理、10000～15000rcf离心处理、农杆菌侵染后于盐浓度50％～100％的共培养培养基培养，然后转接到选择培养基选择培养获得愈伤组织，然后经过再生培养获得再生幼苗。
2.根据权利要求1所述的提高农杆菌介导的玉米遗传转化率的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的提高农杆菌介导的玉米遗传转化率的方法，其特征在于，s1中，处理幼胚温度为43℃。
4.根据权利要求2所述的提高农杆菌介导的玉米遗传转化率的方法，其特征在于，s2中，相对离心力为10000rcf转速。
5.根据权利要求2所述的提高农杆菌介导的玉米遗传转化率的方法，其特征在于，s4中，共培养培养基的盐浓度为50％。
6.根据权利要求2所述的提高农杆菌介导的玉米遗传转化率的方法，其特征在于，s1中，侵染培养基配方为：ms培养基基础盐4.3g，蔗糖68.5g，葡萄糖36g，l-脯氨酸0.7g，mes水合物0.5g，2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)1.5mg，乙酰丁香酮19.6mg，1000×ms维生素溶液1ml，ph值5.2。
7.根据权利要求2所述的提高农杆菌介导的玉米遗传转化率的方法，其特征在于，s3中，agl1农杆菌菌液制备过程为：将含有植物表达载体pfgc5941的...
【专利技术属性】
技术研发人员：董永彬，潘梦影，李玉玲，张龙，朱俊杰，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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