本发明专利技术公开了一种黄烷酮3‑羟化酶突变体及其基因工程菌与应用，属于基因工程和酶学研究领域。所述的黄烷酮3‑羟化酶突变体是由黄烷酮3‑羟化酶氨基酸序列第221位单突变为丙氨酸获得的，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。本发明专利技术还提供了编码所述突变体的基因及含有该基因的重组工程菌株；所述突变体能够提高二氢槲皮素的产量，且产物含量是野生型酶的1.67倍。
1、二氢槲皮素，又称为花旗松素(dihydroquercetin，dhq)，是一种具有生物活性的黄酮类化合物。由于dhq具有抗氧化、抗病毒和抗癌等生物活性，已成为重要的膳食补充剂和功能食品，在神经退行性疾病、高血压和病毒感染等多种疾病的预防和治疗方面显示出潜在的治疗价值。利用基因工程和酶工程等技术对细胞工厂进行改造优化，已成为高效、可持续生产这类有价值天然产物的有效方法。其优点包括生产周期短、生产强度高，且不受季节限制。酿酒酵母已在生物合成各种黄酮类化合物方面取得显著成功，包括花青素、灯盏花素、儿茶素和山奈酚等。
2、黄烷酮-3-羟化酶(flavanone-3-hydroxylase，f3h)是2-氧代戊二酸依赖性双加氧酶家族的一员，在黄酮类化合物的生物合成途径中扮演重要角色。其主要功能是催化柚皮素(naringenin，nar)或圣草酚(eriodictyol，eri)的c环第3位羟基化，分别形成二氢山奈酚(dihydrokaempferol dhk)和dhq。然而，在dhq的合成过程中，一个常见的挑战是多个中间体的同时积累，尤其是eri和dhk，因此f3h被认为是dhq羟基化过程中的限速酶。克服这一挑战有效方法是通过蛋白质工程优化酶的特性，包括定向进化、理性设计、计算机辅助设计和基于机器学习的设计。这些手段可以提高酶的催化效率、热稳定性、底物选择性和ph适应性，对于有效地促进类黄酮合成具有重要的工业意义。
/>技术实现思路
1、本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种黄烷酮3-羟化酶突变体。
2、本专利技术的第二目的在于提供编码上述黄烷酮3-羟化酶突变体的核酸分子。
3、本专利技术的第三目的在于提供用于一种重组表达质粒。
4、本专利技术的第四目的在于提供一种基因工程菌。
5、本专利技术的第五目的在于提供上述黄烷酮3-羟化酶突变体或上述基因工程菌在制备二氢槲皮素中的应用。
6、本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
7、一种黄烷酮3-羟化酶突变体，是由黄烷酮3-羟化酶(mdf3h)突变得到，其氨基酸序列如seq id no.5所示。本专利技术将该突变体命名为mdf3hp221a。
8、所述的黄烷酮3-羟化酶来源于苹果(malus domestica)，其氨基酸序列如seq idno.1所示，其编码核苷酸的序列如seq id no.2所示。
9、所述的突变是将seq id no.1所示氨基酸序列第221位脯氨酸单突变为丙氨酸。
10、编码上述黄烷酮3-羟化酶突变体的核酸分子，其序列优选如seq id no.6所示。
11、一种重组表达质粒，含有上述核酸分子。
12、所述的重组表达质粒还含有类黄酮3'-羟化酶基因(ghf3’h)和细胞色素p450还原酶基因(smcpr)中的至少一种。
13、所述的黄酮3'-羟化酶来源于非洲菊(gerbera hybrid)；所述的类黄酮3'-羟化酶基因的序列如seq id no.3所示。
14、所述的细胞色素p450还原酶来源于水飞蓟(silybum marianum)；所述的细胞色素p450还原酶基因的序列如seq id no.4所示。
15、所述的重组表达质粒的骨架优选来源于p416gpd。
16、一种基因工程菌，含有上述核酸分子或上述重组表达质粒。
17、所述的基因工程菌是将上述重组表达质粒转入出发菌株得到。
18、所述的出发菌株为酿酒酵母。
19、所述的酿酒酵母为cen.pk背景菌株；更优选地，所述酿酒酵母为菌株imx581。
20、上述基因工程菌在制备二氢槲皮素中的应用，优选包括如下步骤：
21、(1)将上述基因工程菌接入发酵培养基培养；
22、(2)接着加入底物后继续培养，收集发酵产物，得到二氢槲皮素。
23、步骤(1)中所述的发酵培养基优选为ypd液体培养基或sc-ura液体培养基。
24、步骤(1)中所述的培养的条件优选为于28～32℃、150～250rpm培养10～30h；更优选为于30℃，220rpm培养16～24h。
25、步骤(2)所述的底物优选为圣草酚和柚皮素中的至少一种。
26、所述的圣草酚的添加量优选为100～300mg/l；更优选为200mg/l。
27、所述的柚皮素的添加量优选为700～900mg/l；更优选为800mg/l。
28、步骤(2)所述的培养的条件优选为28～32℃、150～250rpm培养80～180h；更优选为30℃、220rpm条件下发酵96～168h。
29、相对于现有技术，本专利技术具有如下有益效果：
30、(1)本专利技术通过对来源于苹果(malus domestica)的黄烷酮3-羟化酶进行改造，构建得到了黄烷酮3-羟化酶突变体，用于生产二氢槲皮素。
31、(2)本专利技术构建得到的突变体大大提高了二氢槲皮素的产量，同时降低了副产物的积累，有效降低了生产成本。
32、(3)本专利技术得到的突变体在20ml发酵体系中以800mg/l柚皮素为底物，发酵168h时二氢槲皮素的产量可达516.84mg/l，是野生型酶的1.67倍，具有较好的应用潜力。
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【技术保护点】
1.一种黄烷酮3-羟化酶突变体，其特征在于：所述的黄烷酮3-羟化酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.编码权利要求1所述的黄烷酮3-羟化酶突变体的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述的核酸分子的序列如SEQ IDNO.6所示。
4.一种重组表达质粒，其特征在于：含有权利要求2或3所述的核酸分子。
5.根据权利要求4所述的重组表达质粒，其特征在于：还含有类黄酮3'-羟化酶基因和细胞色素P450还原酶基因中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的重组表达质粒，其特征在于：
7.一种基因工程菌，其特征在于：含有权利要求2或3所述的核酸分子，或权利要求4～6任一项所述的重组表达质粒。
8.权利要求7所述的基因工程菌在制备二氢槲皮素中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于包括如下步骤：
【技术特征摘要】
1.一种黄烷酮3-羟化酶突变体，其特征在于：所述的黄烷酮3-羟化酶突变体的氨基酸序列如seq id no.5所示。
2.编码权利要求1所述的黄烷酮3-羟化酶突变体的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述的核酸分子的序列如seq idno.6所示。
4.一种重组表达质粒，其特征在于：含有权利要求2或3所述的核酸分子。
5.根据权利要求4所述的重组...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄明涛，潘雨阳，颜志波，薛松绿，肖楚凡，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：
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