【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微流控领域，更具体地涉及一种集核酸提取纯化单元与单分子检测单元为一体的多重pcr微流控芯片及其应用。
技术介绍
1、核酸检测技术是近年来应用最为广泛的一种分子诊断技术,在感染性疾病诊断中此类技术可快速高效扩增病原菌的特征性核苷酸序列,已在临床诊断、疾病筛查等领域中得到广泛应用。传统的核酸检测步骤通常包括：样本灭活、核酸提取与纯化、核酸扩增和检测等步骤。其中核酸提取与纯化则是分子生物学实验中的关键，其关系着能否提取出高质量的核酸，将直接影响后续试验的成败。对于核酸提取纯化，目前试剂盒提供的试剂常常步骤繁琐需要耗费较长时间且由于操作方式或实验环境易引发交叉污染，所以对医疗人员的实验能力和检测环境有较高要求。
2、而核酸扩增和检测则是将提取纯化的病原菌特征性核苷酸序列进行高效快速扩增并进行荧光或可视化检测，以获得即时诊断结果。核酸扩增方法的时长、灵敏度及特异性也将直接影响后续结果的判读。目前核酸扩增检测常用的方法为实时荧光定量pcr，其可以对样品中的核酸进行定性和定量分析，为目前核酸扩增检测的金标准。但其缺点在于该方法的定量分析必须依赖标准曲线的存在，无法实现核酸分子的绝对定量，并且在核酸含量低时无法检测低丰度的靶基因，造成假阴性的结果。
3、中国专利申请202311026752.0公开了“一种集核酸提取纯化与数字化检测为一体的多重pcr微流控芯片及其应用”，但是该芯片需要多次加热，需要经过两个步骤进行试剂预混，且磁珠移动不流畅。因此，核酸提取检测一体化的操作装置在分子诊断领域的应用还存在尚需解决
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种集核酸提取纯化单元与单分子检测单元为一体的多重pcr微流控芯片及其应用，从而解决现有核酸扩增和检测技术存在的一体化集成检测难、操作方式繁琐的问题。
2、为了解决上述问题，本专利技术采用以下技术方案：
3、根据本专利技术的第一方面，提供一种集核酸提取纯化与单分子检测为一体的多重pcr微流控芯片，包括：核酸提取模块，其包括：依次连接的裂解腔、第一洗涤腔、第二洗涤腔，各腔体之间通过管道连通，通过在管道内填充油相可使各反应试剂互不串扰；pcr检测模块，其包括：用于提供反应室的若干微腔，设置于所述第二洗涤腔和所述微腔之间的阻隔柱，与所述第二洗涤腔间隔布置且与所述微腔的入口处连接的加液孔，在所述微腔的出口处与所述微腔连通的负压孔；其中，由于表面张力的存在，使得在所述阻隔柱之间形成阻力墙，反应液与油相互不相容，所述多重pcr微流控芯片实现片上的核酸提取纯化与数字化单分子检测。
4、优选地，所述阻隔柱的长度和宽度均为80～120μm，相邻阻隔柱之间保持90～110μm的间隙。更优选地，阻隔柱尺寸长宽各100μm，相邻阻隔柱之间间隔100μm。
5、优选地，所述pcr检测模块采用pdms材料与硅基材料键合而成，所述微腔通过预先在所述硅基材料上表面cvd法沉积二氧化硅，再采用深硅刻蚀工艺加工而成。
6、优选地，裂解腔、洗涤腔、以及微腔反应室沿着一条轴线依次布置。
7、优选地，裂解腔、洗涤腔、洗脱腔之间通过底部连通的管道连接。
8、根据本专利技术的第二方面，提供一种集核酸提取纯化与数字化单分子检测为一体的多重pcr微流控芯片在检测病原体中的应用。
9、优选地，所述应用包括以下步骤：s1，准备阶段：通过裂解腔依次将第二洗涤液、油相、第一洗涤液、油相、核酸裂解液注入，使第二洗涤液、第一洗涤液、核酸裂解液分别被注入第二洗涤腔、第一洗涤腔、裂解腔，并通过油相隔开，接着通过加液孔加入反应液使其充满微腔；s2，核酸的提取纯化：将含有病原体的样品注入裂解腔，在核酸裂解液的作用下病原体被裂解，释放的核酸分子被磁珠吸附，手持永磁体拖动磁珠依次进入第一洗涤腔、第二洗涤腔，完成核酸分子的洗涤；s3，微腔进样：通过永磁体将磁珠拖入pcr检测模块的微腔中，使磁珠均匀分布在每个微腔中，每个微腔形成一个反应室，再通过加液孔加入油相，油相推动多余反应液从负压孔排出，使每个微腔形成独立的反应单元；s4，pcr扩增检测：在加热模块的作用下，核酸分子在微腔反应室中完成pcr反应，通过仪器对荧光基团发出的不同波长进行检测，即可实现对病原体的精准定量检测。
10、优选地，核酸分子通过手持永磁体拖动磁珠依次穿过裂解腔、洗涤腔，逐步完成核酸分子的吸附与富集、洗涤。
11、针对现有技术的不足，专利技术人在已有的研究基础上进一步查阅文献，将核酸提取纯化技术与灵敏度更高的单分子检测技术以及磁控技术在微流控芯片中集成。本专利技术在原有芯片基础之上进一步简化了磁珠的移动，简化了裂解过程的加热，简化了预混步骤，提供了一种集核酸提取纯化与单分子检测及磁控技术一体化的高灵敏、简易操作装置，可以实现多重pcr反应，同时检测多种病原体。目前商业simoa公司的硅基单分子检测只能进行片上的扩增，做不到片上的核酸提取纯化。然而，本专利技术的技术优势即在于，可实现芯片上核酸提取纯化，再结合高灵敏的单分子检测技术以及磁控技术移动磁珠，实现磁珠在微腔中的均匀分布，然后进行多重pcr的反应。本专利技术将核酸提取纯化与数字化pcr检测集成一体化，基于水和油表面张力不相混溶界面设计了核酸提取纯化部分，芯片将核酸提取纯化试剂(包括核酸裂解液、洗涤液)通过油相分隔在单独的腔室内，保证了各个试剂在操作过程中反应独立进行并且不发生互相干扰。同时，核酸分子的转移通过手持永磁体拖动磁珠经底部连接通道穿梭于各个试剂液滴中完成核酸分子的吸附与富集、洗涤。然后再用永磁体拖着磁珠进入扩增区，使磁珠均匀分布在微腔中，在通过加液孔注入油相，将多余反应液由负压孔排出，使每个微腔形成单独的反应腔室。在核酸提取纯化部分制备样本的基础上设计了多重pcr检测部分，通过pcr扩增后，在仪器中对荧光基团发出的不同波长进行检测。
12、根据本专利技术提供的一种集核酸提取纯化与单分子检测为一体的多重pcr微流控芯片及其应用，相对于现有技术具有以下有益效果：
13、1)该多重pcr微流控芯片将样本制备及多重pcr检测集成在一起，能够在同一个芯片上实现对病原体的核酸提取纯化和pcr检测以及精准定量检测；
14、2)本专利技术特别设计的水油分离结构在核酸提取纯化部分具有试剂分隔作用，保证了各个试剂在操作过程中反应独立进行并且不发生互相干扰；
15、3)本专利技术特别设计的水油分离结构阻隔柱，在核酸纯化区和扩增区之间的微流道中加入阻隔柱，利用水相和油相的表面张力，形成互不干扰的阻隔墙；
16、4)根据本专利技术提供的多重pcr微流控芯片在分子诊断领域具有潜在的应用性。
17、总之，本专利技术提供了一种集核酸提取纯化与数字化单分子检测为一体的多重pcr微流控芯片及其应用，将样本制备及数字pcr单分子检测集成在一起，能够应用于病原体的精准定量检测，与现有的病原体检测平台相比，其在检测灵敏度、流程自动化、集成度等方面具有很大的优势，在分子诊断方面具有广阔的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种集核酸提取纯化与单分子检测为一体的多重PCR微流控芯片，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的多重PCR微流控芯片，其特征在于，所述阻隔柱的长度和宽度均为80～120μm，相邻阻隔柱之间保持90～110μm的间隙。
3.根据权利要求1所述的多重PCR微流控芯片，其特征在于，所述PCR检测模块采用PDMS材料与硅基材料键合而成，所述微腔通过预先在所述硅基材料上表面CVD法沉积二氧化硅，再采用深硅刻蚀工艺加工而成。
4.根据权利要求1所述的多重PCR微流控芯片，其特征在于，裂解腔、第一洗涤腔、第二洗涤腔以及微腔沿着一条轴线依次布置。
5.根据权利要求1所述的多重PCR微流控芯片，其特征在于，裂解腔、第一洗涤腔、第二洗涤腔之间通过底部连通的管道连接。
6.一种根据权利要求1～5中任意一项所述的集核酸提取纯化与数字化单分子检测为一体的多重PCR微流控芯片在检测病原体中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，核酸分子
...【技术特征摘要】
1.一种集核酸提取纯化与单分子检测为一体的多重pcr微流控芯片，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的多重pcr微流控芯片，其特征在于，所述阻隔柱的长度和宽度均为80～120μm，相邻阻隔柱之间保持90～110μm的间隙。
3.根据权利要求1所述的多重pcr微流控芯片，其特征在于，所述pcr检测模块采用pdms材料与硅基材料键合而成，所述微腔通过预先在所述硅基材料上表面cvd法沉积二氧化硅，再采用深硅刻蚀工艺加工而成。
4.根据权利要求1所述的多重pcr微流控芯片，其特征在于，裂解腔、第一洗涤腔、第...
【专利技术属性】
技术研发人员：程建鑫，冯世伦，刘博，胡钧，赵建龙，
申请(专利权)人：祥符实验室，
类型：发明
国别省市：
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