【技术实现步骤摘要】
本申请涉及生物，特别是涉及一种病原体耐药基因检测方法、试剂盒及装置。
技术介绍
1、病原体耐药基因检测是指对病人(宿主)体内的核酸进行测序，分析测序得到的核酸序列，根据其中的特异性保守序列确定病原体的种类和突变亚型(病原体检测)及该病原体携带的耐药基因(耐药基因检测)。
2、现有的病原体耐药基因检测通常通过如下方式实现：
3、一、利用一代测序实现病原体耐药基因检测：
4、第一代测序的成本低廉、测序结果也足以满足检测准确性的需求，因而广泛使用于各个生物检测机构的检测业务中，普及范围大。但是第一代测序的缺陷就是若要保持低成本、准确性及测序时长的要求，只能满足100～900nt(bp)长度的核酸序列检测。如果病原体的特异性保守序列与其耐药基因相距较近，能够通过短片段长度即可同时确定种类、亚型、耐药性，则可以通过第一代测序进行检测。若不能通过短片段同时确定，则仅能够确定其种类亚型或耐药性中的一项，至于耐药性基因是否为该病原体所携带，无法得知。
5、因而第一代测序的缺陷在于，仅能够满足特异性保守序列与耐药基因相近时，才能同时知悉病原体的种类亚型及耐药性，适用范围有限。
6、二、利用二代测序实现病原体耐药基因检测：
7、第二代测序相较于第一代测序的优点在于，第二代测序能够在保持测序结果的正确性的同时，满足短时间内高通量的测序。虽然第二代测序读长相较于第一代测序的读长没有明显的优势，但是利用第二代测序的高通量的特点，通过不同的测序结果重叠区域的拼接，足以获取病原体的全基因
8、三、利用三代测序实现病原体耐药基因检测：
9、第三代测序的优点在于，其可满足单分子长片段测序。但是第三代测序的缺陷在于成本高昂、且测序错误率高，普及度明显低于第一代和第二代测序。
10、现有的病原体耐药检测主要以二代测序为主，二代测序存在读长限制，因而，二代测序病原体耐药基因检测的实现方法有如下两种：
11、多重pcr法：
12、1，收集样本并提取样本中的核酸片段；
13、2，逆转录(若存在rna遗传病原体则需要该步骤，否则省略)；
14、3，预先根据病原体的特异性保守序列，设计扩增引物；
15、4，将扩增引物与病原体的遗传样本杂交，进行第一轮扩增，得到扩增片段；
16、5，对扩增片段进行第二轮扩增并测序。
17、该方法的优点在于步骤简单，操作成本低，但是缺陷在于：宿主与病原体之间、或病原体与样本中的非致病生物遗传序列之间存在同源序列，该方法在进行拼接时会出现遗传信息干扰，病原体携带的耐药基因可能来自于宿主或样本中其它非致病遗传生物；同时，即使针对同一病原体，也会设计多个引物以获取病原体不同位置的扩增片段，引物种类多，引物之间的关系复杂，互相存在干扰；不同扩增片段的cg占比不同，扩增后的均一性差，容易出现致病病原体判断错误的情况。
18、全覆盖探针法：
19、1，收集样本并提取样本中的核酸片段；
20、2，逆转录(若存在rna遗传病原体则需要该步骤，否则省略)；
21、3，打断核酸片段；
22、4，预先根据病原体的特异性保守序列及捕获长度设计一套探针；
23、5，建库、探针杂交捕获；
24、6，扩增并测序。
25、探针法的优点在于特异性强，能够减少宿主的干扰；缺点是操作成本高：需要经过打断、纯化、杂交捕获等操作；且若打断后捕获的核酸片段上仅携带特异性保守序列，而未携带致病基因，则无法得知病原体是否携带或携带哪种耐药基因。
技术实现思路
1、基于上述技术方案的缺陷，本专利技术提出一种病原体耐药基因检测方法，基于所述方法，本专利技术还公开了一种病原体耐药基因检测试剂盒及病原体耐药基因检测装置。
2、本专利技术通过以下技术方案实现的：
3、一种病原体耐药基因检测方法，包括以下步骤：
4、获取待测样本中的核酸片段；
5、将带有生物素标记的特异性引物与病原体核酸片段杂交；
6、通过链置换dna聚合酶延伸特异性引物，得到多个延伸产物；
7、通过生物素标记获取所述延伸产物；
8、对所述延伸产物建库并测序。
9、进一步的，根据病原体的特异性保守序列设计多个特异性引物。
10、进一步的，所述特异性引物包括若干个针对组，每个所述针对组包括3至5个特异性引物，每个所述针对组对应一种病原体。
11、进一步的，所述病原体为病毒、真菌和/或细菌。
12、进一步的，所述病原体核酸片段为rna时，所述获取待测样本中的核酸片段之后还包括：
13、逆转录核酸片段，保留逆转录后的dna核酸片段。
14、进一步的，所述链置换dna聚合酶为phi29dna聚合酶。
15、进一步的，所述测序为二代测序法，所述建库具体包括：
16、以所述延伸产物为模板，以随机碱基序列为引物进行二链合成，生成待检测双链；
17、对待检测双链进行酶切及末端修复，获得多个待检测片段；
18、在待检测片段两侧加上接头，并扩增加上接头的待检测片段。
19、进一步的，所述随机碱基序列为长度为5的核酸片段。
20、一种病原体耐药基因检测试剂盒，包括：特异性引物、pcr反应液、酶混合液；
21、所述pcr反应液包括dntp及缓冲液；
22、所述酶混合液包括链置换dna聚合酶。
23、一种病原体耐药基因检测装置，包括：
24、延伸反应模块，用于特异性引物与病原体杂交并延伸，获取延伸产物；
25、建库模块，用于获取延伸产物并对延伸产物进行建库；
26、测序模块，用于对待测样本进行基因测序，获得平均测序深度下的测序数据；
27、比对模块，用于将所述测序数据与从基因数据库中获取的同源耐药基因序列进行比对，得到多条比对记录以及每条比对记录对应的比对质量值；
28、过滤模块，用于根据所述比对质量值过滤掉所述多条比对记录中的非最优比对，得到每个基因正确比对记录的条数。
29、本专利技术的有益效果在于：
30、相比于现有技术，本方案可以同时适用于二代测序和三代测序，满足大多数的实验室测序条件；
31、本专利技术中在开始阶段采集到含有病原体的核酸样本后，不需要将核酸样本打断，而是直接使特异性引物与病原体核酸结合，省略了打断步骤、降低了实验操作的复杂度和操作成本。
32、同时，本方法结合了多重pcr法和探针法的优点：
33、1.利用特异性引物仅与病原体杂交的特异性，屏蔽宿主信息的干扰；
34、2.以特异性引物作为延伸引物，病原体的特征性保守本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种病原体耐药基因检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的病原体耐药基因检测方法，其特征在于，根据病原体的特异性保守序列设计多个特异性引物。
3.根据权利要求1或2所述的病原体耐药基因检测方法，其特征在于，所述特异性引物包括若干个针对组，每个所述针对组包括3至5个特异性引物，每个所述针对组对应一种病原体。
4.根据权利要求1所述的病原体耐药基因检测方法，其特征在于，所述病原体为病毒、真菌和/或细菌。
5.根据权利要求4所述的病原体耐药基因检测方法，其特征在于，所述病原体核酸片段为RNA时，所述获取待测样本中的核酸片段之后还包括：
6.根据权利要求1所述的病原体耐药基因检测方法，其特征在于，所述链置换DNA聚合酶为phi29 DNA聚合酶。
7.根据权利要求1所述的病原体耐药基因检测方法，其特征在于，所述测序为二代测序法，所述建库具体包括：
8.根据权利要求7所述的病原体耐药基因检测方法，其特征在于，所述随机碱基序列为长度为5的核酸片段。
9.一种病原体耐药基因
10.一种病原体耐药基因检测装置，其特征在于，包括：
...【技术特征摘要】
1.一种病原体耐药基因检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的病原体耐药基因检测方法，其特征在于，根据病原体的特异性保守序列设计多个特异性引物。
3.根据权利要求1或2所述的病原体耐药基因检测方法，其特征在于，所述特异性引物包括若干个针对组，每个所述针对组包括3至5个特异性引物，每个所述针对组对应一种病原体。
4.根据权利要求1所述的病原体耐药基因检测方法，其特征在于，所述病原体为病毒、真菌和/或细菌。
5.根据权利要求4所述的病原体耐药基因检测方法，其特征在于，所述病原体核酸片段为rna...
【专利技术属性】
技术研发人员：程云阳，操利超，巴颖，卢晓萍，余彪，余多海，梁雨，
申请(专利权)人：深圳核子华曦医学检验实验室，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。