【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种猪传染性胃肠炎病毒igg抗体的免疫磁珠检测试剂盒及其应用。
技术介绍
1、猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis，tge)，是由猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritisvirus，tgev)引起的一种急性、高度接触性传染病。临床上常表现为水样腹泻、呕吐和脱水等，各年龄段的猪是该病的主要易感宿主，但10日龄以内的仔猪发病普遍表现出较高的死亡率。目前已有疫苗的投放市场，但是快速准确地疾病诊断和疫苗免疫评价对于该病的防控至关重要。tge与许多腹泻类疾病症状相似，实验室诊断是判断病猪是否患tgev的主要手段。常用的检测tgev的主要实验室检测技术包括：病毒分离和鉴定、血清学检测、免疫学和分子生物学方法。然而，这些方法周期长、操作复杂繁琐，需要专业的技术人员和特定的仪器才可以完成，很难满足临床样品的快速、廉价、高效监测的要求。
2、免疫磁珠(immunomagneticbeads，imbs)是一种新型磁性纳米粒子材料，是运用核-壳的合成方法合成含有超顺磁性物质的高分子表面覆盖的复合材料，其稳定性好、能进行后期标记，利用这些物质表面的功能基团如氨基、羧基、巯基等进行抗原蛋白的共价或者非共价偶联，可用于检测结合相应的抗体。但磁珠表面容易发生非特异性吸附，若抗原的选择不合理，容易对检测特异性产生不良影响，现有技术中很少有关于检测tgevigg抗体的免疫磁珠的记载。
技术实现思路
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2、本专利技术提供了一种检测猪传染性胃肠炎病毒igg抗体的免疫磁珠，所述免疫磁珠包括羧基磁珠和包被在所述羧基磁珠上的tgev-n蛋白；所述tgev-n蛋白的氨基酸序列在genbank上的登录号为ay587884.1；
3、所述免疫磁珠的制备方法包括以下步骤：
4、对羧基磁珠进行活化，将活化后的羧基磁珠和tgev-n蛋白溶液混合，于37℃孵育20～60min，磁分离后弃上清，洗涤后加入封闭液，37℃封闭2h，得到免疫磁珠；
5、所述封闭液包括1wt.％～5wt.％牛血清白蛋白和/或1wt.％～5wt.％脱脂奶粉。
6、优选的，所述羧基磁珠和tgev-n蛋白的质量比为25～50：1～2。
7、优选的，所述活化的方式包括：
8、对所述羧基磁珠进行磁分离，然后用mest溶液重悬磁珠，再次进行磁分离后弃上清，洗涤后加入混合液，37℃孵育30min，磁分离后弃上清，用pbs溶液充分混悬并洗涤，磁分离后弃上清，得到活化后的羧基磁珠；
9、所述混合液包括1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺；所述混合液中1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的终浓度为1～10mg/ml，n-羟基丁二酰亚胺的终浓度为1～10mg/ml。
10、优选的，所述羧基磁珠和mest溶液的体积比为1：2～6；所述羧基磁珠和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐+n-羟基丁二酰亚胺混合液的体积比为1：2～6。
11、本专利技术还提供了上述技术方案所述的免疫磁珠在制备检测猪传染性胃肠炎病毒igg抗体的产品中的应用。
12、本专利技术还提供了一种检测猪传染性胃肠炎病毒igg抗体的试剂盒，包括上述技术方案所述的免疫磁珠。
13、优选的，所述试剂盒中还包括稀释液、洗涤液、酶标二抗、显色液、终止液、阴性标准品和阳性标准品。
14、优选的，所述稀释液为含有10wt.％牛血清蛋白和0.1v/v％proclin-300的0.01m的pbs溶液，所述稀释液的ph为7.4；
15、所述洗涤液为pbst溶液，所述pbst溶液中含有0.01m的0.05v/v％tween20，所述洗涤液的ph为7.4；
16、所述酶标二抗为hrp标记的羊抗猪igg单抗，所述hrp标记的羊抗猪igg单抗的浓度为1mg/ml；所述酶标二抗的滴度为1：2000～16000；
17、所述显色液包括a液和b液，所述a液包括如下浓度的组分：10～50g/l无水乙酸钠、1～5g/l柠檬酸和1～10mmol/l过氧化氢；
18、所述b液包括如下浓度的组分：0.1～1.0g/l乙二胺四乙酸二钠、1～5g/l柠檬酸、1～10v/v％甘油和0.1～1.0g/l3,3',5,5'-四甲基联苯胺；
19、所述终止液为2mol/l的h2so4溶液；
20、所述阳性标准品为tgev抗体阳性的猪血清；
21、所述阴性标准品为含未感染tgev的猪血清。
22、本专利技术还提供了一种非诊断目的检测猪传染性胃肠炎病毒igg抗体的方法，包括以下步骤：
23、将上述技术方案所述免疫磁珠和待测样品进行第一孵育后洗涤，加入酶标二抗进行第二孵育，加入显色液进行显色，显色时长为5～20min；检测450nm波长处的吸光度值；根据od450nm的吸光度值判断结果：
24、od450nm≥0.4191时，所述待测样品为阳性，即所述待测样本含有猪传染性胃肠炎病毒igg抗体；od450nm＜0.4191时，所述待测样品为阴性，即所述待测样本不含有猪传染性胃肠炎病毒igg抗体。
25、优选的，所述第一孵育的温度为37℃，时间为30min；所述第二孵育的温度为37℃，时间为10min；
26、优选的，所述洗涤包括用200～1000μl洗涤液冲洗1～5次。
27、有益效果
28、本专利技术提供了一种检测猪传染性胃肠炎病毒igg抗体的免疫磁珠，所述免疫磁珠是以表面修饰的羧基磁性微球为载体，进一步利用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)+n-羟基丁二酰亚胺(nhs)混合液将磁珠活化直接与tgev-n蛋白进行偶联，提高了蛋白的负载效率，然后封闭未结合的位点，制备免疫磁珠。本专利技术所提供的免疫磁珠能将血清样本中含有的tgev特异性抗体精准捕获，hrp标记的羊抗猪多克隆抗体作为检测抗体能与免疫磁珠上tgev-n蛋白的特异性抗体结合，确保了免疫磁珠的检测特异性。
29、进一步的，本专利技术通过调整封闭液组成与反应条件，使封闭液中的蛋白组分充分占据磁珠表面未与tgev-n蛋白结合的羧基基团，有效抑制了磁珠表面非特异性吸附的发生，进一步提高了检测效率，使得本专利技术所提供的免疫磁珠能够高效、特异地检测猪传染性胃肠炎病毒igg抗体，提高检测的灵敏度。
30、本专利技术所提供的检测猪传染性胃肠炎病毒igg抗体的免疫磁珠检测方法，将待检血清与免疫磁珠共同孵育，免疫磁珠能够将tgev-n特异性igg抗体从反应液中精准捕获，hrp标记的山羊抗猪多克隆抗体作为检测抗体与免疫磁珠上tgev-n蛋白的特异性抗体结本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测猪传染性胃肠炎病毒IgG抗体的免疫磁珠，其特征在于，所述免疫磁珠包括羧基磁珠和包被在所述羧基磁珠上的TGEV-N蛋白；所述TGEV-N蛋白的氨基酸序列在GenBank上的登录号为AY587884.1；
2.根据权利要求1所述的免疫磁珠，其特征在于，所述羧基磁珠和TGEV-N蛋白的质量比为25～50：1～2。
3.根据权利要求1所述的免疫磁珠，其特征在于，所述活化的方式包括：
4.权利要求1～3任一项所述的免疫磁珠在制备检测猪传染性胃肠炎病毒IgG抗体的产品中的应用。
5.一种猪传染性胃肠炎病毒IgG抗体的免疫磁珠检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的免疫磁珠。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括稀释液、洗涤液、酶标二抗、显色液、终止液、阴性标准品和阳性标准品。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液为含有10wt.％牛血清蛋白和0.1v/v％Proclin-300的0.01M的PBS溶液，所述稀释液的pH为7.4；
8.一种非
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第一次孵育的温度为37℃，时间为30min；所述第二次孵育的温度为37℃，时间为5～20min。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述洗涤包括用200～1000μL洗涤液冲洗1～5次。
...【技术特征摘要】
1.一种检测猪传染性胃肠炎病毒igg抗体的免疫磁珠，其特征在于，所述免疫磁珠包括羧基磁珠和包被在所述羧基磁珠上的tgev-n蛋白；所述tgev-n蛋白的氨基酸序列在genbank上的登录号为ay587884.1；
2.根据权利要求1所述的免疫磁珠，其特征在于，所述羧基磁珠和tgev-n蛋白的质量比为25～50：1～2。
3.根据权利要求1所述的免疫磁珠，其特征在于，所述活化的方式包括：
4.权利要求1～3任一项所述的免疫磁珠在制备检测猪传染性胃肠炎病毒igg抗体的产品中的应用。
5.一种猪传染性胃肠炎病毒igg抗体的免疫磁珠检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的免疫磁珠。
6.根据权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：项玉强，魏战勇，郭东辉，刘君君，宋润泽，胡慧，李永涛，张红垒，郑兰兰，陈丽颖，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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