【技术实现步骤摘要】
技术介绍
1、液体活检以其无创或微创性而闻名，通过检测循环肿瘤细胞、外泌体、cfdna、mrna、micrornas(mirnas)、蛋白质或代谢物等，在肿瘤早筛或癌前病变方面显示出良好的潜力。其中cfdna是癌细胞凋亡过程中脱落的细胞外核酸片段；坏死或分泌，是早期发现的最有希望的方法。cfdna表现出癌症相关遗传和表观遗传的改变，通过第二代测序，可以获悉包括突变，拷贝数改变，染色体重排、高甲基化和低甲基化等信息。与传统的癌症筛查相比，cfdna检测显示出几个优势，使其成为早期发现癌症的理想方法。首先，从理论上讲，血液中是否存在异常的cfdna可以通过检测来确定超早期癌症，在常规临床测量的阈值之前，扩大了早期干预的时间窗口。第二，cfdna通过提供有关起源组织的信息，检测可以同时检测多种癌症。最后，cfdna有潜力描述整个分子和表观遗传景观，不考虑肿瘤内异质性，帮助精确治疗和监测复发后早期检测。
2、然而，cfdna在血浆中含量极低，而且不稳定。cfdna的半衰期为16分钟至2.5小时。在体内，cfdna要么在由肾脏代谢成尿液排泄之前被核酸酶清除，要么被肝脏和脾脏吸收，然后被巨噬细胞降解。导致构建cfdna测序文库的成功率低、测序数据背景干扰因素较多。传统方法一般通过加大样本量，比如用5毫升甚至更多血浆进行提取，这限制了cfdna作为液体活检的推广和普及。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术提供一种提取效率高、稳定性好的血浆cfdna二代测序全流程的构建方
2、本专利技术的技术方案为：
3、一种高效稳定的血浆cfdna二代测序全流程的构建方法，包括以下步骤：
4、(1)收集全血样本；
5、(2)对全血样本进行两次离心，得到无血细胞污染的血浆；
6、(3)取所述血浆进行前处理，再自动化提取cfdna：
7、(4)构建文库：对所述cfdna依次进行末端修复、接头连接、pcr扩增及纯化后，获得测序文库；
8、(5)使用华大t7平台进行测序，每个样本仅需6g低深度测序数据，即可满足后续分析。
9、步骤(1)中，使用游离dna采血管收集全血，内含抗凝剂和核酸酶抑制剂，能最大限度的防止核酸的降解，白细胞破裂造成的基因组dna释放，保证了从采血，到运输至实验室过程中，cfdna的损失尽可能减少，其他可能的污染尽可能减少。且能常温运输，无需冷冻样本，减少了样本的冻融次数。
10、步骤(2)中，对收集后的全血先进行1600g、10分钟的低温离心，得到上层血浆；之后将所述上层血浆进行16000g、10分钟的高速离心，使得获得血浆样本尽可能去除细胞等杂质，减少污染。
11、步骤(3)中，取600μl血浆进行前处理；对血浆样本进行的所述前处理的具体操作为：
12、向血浆中加入蛋白酶k溶液和蛋白酶k孵育缓冲液，涡旋混匀后，置于水浴锅60℃孵育45分钟，孵育完成后取出样本，置于冰上冷却5分钟至室温。尽可能减少蛋白质与cfdna的交联，释放更多的cfdna，大大提升了我们的提取效率。
13、所述蛋白酶k溶液的加入量占所述血浆的体积百分数为1-3％，所述蛋白酶k孵育缓冲液的加入量占所述血浆的体积百分数为4-6％。
14、步骤(3)中，采用高通量机提方法对前处理后的血浆样本进行所述cfdna的提取。每一步需要的试剂和操作都是经过优化后的最佳值。提取效率高于仪器本身推荐的程序。提取结果(核酸浓度)和后续测序结构稳定性明显高于手提。
15、所述高通量机提程序具体如下：
16、(a)灌装诺唯赞自动提取仪深孔板。每六列为一组，第一、二列加入450μl裂解结合液和6μl磁珠；第三列加入400μl漂洗液；第四、五列加入400μl 80％乙醇；第六列加入40μl洗脱液。所用试剂为诺唯赞核酸提取试剂盒n913；
17、(b)向第一，二列孔中各加入300μl样本。上机。打开仪器盖子，放置好深孔板；插上磁棒套。开机后，选择对应的程序，具体步骤如下：
18、
19、点击运行；
20、(c)提取仪运行结束后，取出深孔板。尽可能将洗脱液吸干净，置于干净的1.5mlep管中，盖上管盖，得到cfdna产物。
21、步骤(4)中，对cfdna进行末端补平，在5’端进行磷酸化和3’端加da尾。根据提取到的cfdna浓度，取1ng cfdna样本并补水至50μl，放置冰上备用。具体操作如下：
22、a1)将末端反应缓冲液解冻，末端反应酶颠倒混匀后，0.1-0.5秒短暂离心后将试剂置于冰上备用；
23、b1)在cfdna样本管中，按如下体积加入试剂，并在冰上进行操作：
24、 组分 体积/μl dna 50 末端反应缓冲液 27 末端反应酶 3
25、c1)使用移液器轻轻吹打20次混匀，并0.1-0.5秒短暂离心将反应液收集至管底；
26、d1)将样本管置于pcr仪中，进行下述反应：
27、 温度 时间 热盖105℃ on 20℃ 30min 65℃ 30min 4℃ 持续
28、e1)反应结束后，将样本取出并0.1-0.5秒短暂离心将反应液收集至管底，放置冰上，并立即进行下一步实验。
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1.一种高效稳定的血浆cfDNA二代测序全流程的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的高效稳定的血浆cfDNA二代测序全流程的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，使用游离DNA采血管收集全血；
3.根据权利要求1所述的高效稳定的血浆cfDNA二代测序全流程的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，取600μL血浆进行前处理；对血浆样本进行的所述前处理的具体操作为：
4.根据权利要求3所述的高效稳定的血浆cfDNA二代测序全流程的构建方法，其特征在于，所述蛋白酶K溶液的加入量占所述血浆的体积百分数为1-3％，所述蛋白酶K孵育缓冲液的加入量占所述血浆的体积百分数为4-6％。
5.根据权利要求1所述的高效稳定的血浆cfDNA二代测序全流程的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，采用高通量机提方法进行所述cfDNA的提取；所述自动化提取cfDNA的提取程序设计为：
6.根据权利要求1所述的高效稳定的血浆cfDNA二代测序全流程的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，对所述cfDNA进行末端修复的具体操作如下：p>
7.根据权利要求1高效稳定的血浆cfDNA二代测序全流程的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，对所述cfDNA进行接头连接的具体操作如下：
8.根据权利要求1所述的高效稳定的血浆cfDNA二代测序全流程的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，使用DNA磁珠对所述接头连接产物进行纯化，具体操作如下：
9.根据权利要求1所述的高效稳定的血浆cfDNA二代测序全流程的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，对纯化后的接头连接产物进行PCR扩增，具体操作为：
10.根据权利要求1所述的高效稳定的血浆cfDNA二代测序权利路程的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，对PCR扩增反应产物进行纯化的操作具体如下：
...【技术特征摘要】
1.一种高效稳定的血浆cfdna二代测序全流程的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的高效稳定的血浆cfdna二代测序全流程的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，使用游离dna采血管收集全血；
3.根据权利要求1所述的高效稳定的血浆cfdna二代测序全流程的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，取600μl血浆进行前处理；对血浆样本进行的所述前处理的具体操作为：
4.根据权利要求3所述的高效稳定的血浆cfdna二代测序全流程的构建方法，其特征在于，所述蛋白酶k溶液的加入量占所述血浆的体积百分数为1-3％，所述蛋白酶k孵育缓冲液的加入量占所述血浆的体积百分数为4-6％。
5.根据权利要求1所述的高效稳定的血浆cfdna二代测序全流程的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，采用高通量机提方法进行所述cfdna的提取；所述自动化提取cfdna的提取...
【专利技术属性】
技术研发人员：林子奥，邵明，王红杏，陈国梅，
申请(专利权)人：奥明星程杭州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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