【技术实现步骤摘要】
专利
本专利技术涉及用于在哺乳动物宿主细胞中产生抗α4β7抗体的方法和组合物。
技术介绍
1、哺乳动物细胞培养技术常用于生产治疗性生物制剂，包括治疗性单克隆抗体。在制药工业中，哺乳动物细胞通常比其他形式的真核细胞(诸如酵母)或原核细胞(诸如细菌)更优选用于蛋白质生产，因为哺乳动物细胞中产生的蛋白质的翻译后修饰与人体产生的蛋白质更类似。然而，哺乳动物细胞培养可能很困难，因为这些细胞存在许多挑战，特别是在以商业规模制造用于人类的治疗性抗体的情形下。生产方法必须使细胞的抗体产量最大化，同时保持蛋白质产品的安全性以及效率和成本效益。因此，生产需求很重要，因为需要保持所期望的产品质量属性诸如糖基化特征、聚集体水平、电荷异质性和氨基酸序列完整性(li等人,2010,mabs,2(5):466-477)。
2、鉴于细胞培养过程的复杂性，可能难以确定可解决与产生治疗性抗体相关联的挑战的细胞培养参数，包括保持高质量的药物产品，同时产生足够的蛋白质产品以满足制造需求和治疗要求。
技术实现思路
1、尽管哺乳动物细胞培养过程在过去几十年中一直是研究的主题，但仍然需要改进重组抗体的大规模商业生产。哺乳动物宿主细胞培养的细胞活力、寿命和比生产力的增加，以及所产生的重组蛋白滴度的提高对所产生的重组蛋白的价格有真正的影响，并且在治疗性蛋白的情况下，对药物产品的价格和供应有影响。此外，鉴于需要保持所产生的治疗性抗体质量的一致性，此类增加可能尤其具有挑战性。
2、本文提供的专利技术尤其公
3、在一个方面，本专利技术提供了产生包含人源化抗α4β7抗体的组合物的方法，所述方法包括在生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，以及将包含尿苷、锰和半乳糖的补充剂添加到生产培养基中，从而产生包含人源化抗α4β7抗体的组合物，其中哺乳动物宿主细胞被基因工程改造以表达人源化抗α4β7抗体，所述抗体是igg1抗体，包含重链可变区，所述重链可变区包含如seq id no:4所列示的cdr3结构域、如seq id no:3所列示的cdr2结构域和如seq id no:2所列示的cdr1结构域；并且包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如seq idno:8所列示的cdr3结构域、如seq id no:7所列示的cdr2结构域和如seq id no:6所列示的cdr1结构域。
4、在上述方面的一些实施方案中，所述方法是产生人源化抗α4β7抗体的碱性同工型(如通过阳离子交换色谱法(cex)所测定)的量减少的组合物的方法，所述方法包括所述在生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，以及所述将包含尿苷、锰和半乳糖的补充剂添加到生产培养基中，从而产生与在缺少补充剂的情况下培养的表达人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞相比，人源化抗α4β7抗体的碱性同工型的量减少的组合物。
5、在上述方面的一些实施方案中，本专利技术的特征在于一种产生具有约16％或更少的人源化抗α4β7抗体的碱性同工型(如通过cex所测定)的组合物的方法，所述方法包括所述在生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，以及所述将包含尿苷、锰和半乳糖的补充剂添加到生产培养基中，从而产生具有约16％或更少的人源化抗α4β7抗体的碱性同工型的组合物。
6、在一个实施方案中，组合物包含约14％或更少的人源化抗α4β7抗体的碱性同工型。
7、在另一个实施方案中，组合物包含约13％或更少的人源化抗α4β7抗体的碱性同工型。
8、在一个实施方案中，将补充剂添加到生产培养基中或添加到补料培养基中，补料培养基随后被添加到生产培养基中。
9、在一个实施方案中，在补充与收获之间在生产培养基中添加的尿苷的累积浓度为约1至约7mm；其中在补充与收获之间在生产培养基中添加的锰的累积浓度为约0.002至约0.015mm；且/或其中在补充与收获之间在生产培养基中添加的半乳糖的累积浓度为约3至约20mm。在某些实施方案中，补料培养基还包含锌。在一种实施方案中，在补充与收获之间在生产培养基中添加的锌的累积浓度为约0.05mm至约0.045mm。
10、在一个实施方案中，锰作为补充剂多次添加到生产培养基中，每次添加约0.1至10μm、约0.2至1.5μm、约0.2至5μm、约0.25至2μm、约0.3至1.2μm或约0.3至0.8μm。在某些实施方案中，锰作为补充剂多次添加到生产培养基中，每次添加约0.2至1.5μm。
11、在一个实施方案中，尿苷作为补充剂多次添加到生产培养基中，每次添加约25至1000μm、约75至750μm、约55至620μm、约100至600μm、约150至450μm、约100至700μm、约100至600μm或约170至630μm。在某些实施方案中，尿苷作为补充剂多次添加到生产培养基中，添加量为约100至700μm。
12、在一个实施方案中，半乳糖作为补充剂添加多次添加到生产培养基中，每次添加约0.1至10mm、0.2至7.5mm、0.5至5mm、0.4至2.8mm、0.5至3.5mm、0.7至2.9mm、0.75至2.5mm或约1.2mm或1.4mm。在某些实施方案中，半乳糖作为补充剂以约0.5至3.5mm多次添加到生产培养基中。
13、在一个实施方案中，补充剂每天或每两天添加一次。在某些实施方案中，补充剂从生产阶段培养的第4天开始添加。
14、在一个实施方案中，尿苷添加到补料培养基中至最终浓度为约15至120mm。在一个实施方案中，尿苷添加到补料培养基中至最终浓度为约20至70mm尿苷。在一个实施方案中，尿苷添加到补料培养基中至最终浓度为约1至40mm尿苷。
15、在一个实施方案中，锰添加到补料培养基中至最终浓度为约0.02至0.3mm。在一个实施方案中，锰添加到补料培养基中至最终浓度为约0.04至0.15mm。在一个实施方案中，锰添加到补料培养基中至最终浓度为约0.0001至0.1mm。
16、在另一实施方案中，半乳糖添加到补料培养基中至最终浓度为约85mm至600mm。在一个实施方案中，半乳糖添加到补料培养基中至最终浓度为约160至340mm。在一个实施方案中，半乳糖添加到补料培养基中至最终浓度为约50至150mm。
17、在另一个实施方案中，补料培养基还包含锌。在一个实施方案中，补料培养基中锌的浓度为约90μm至120μm。在一个实施方案中，补料培养基中锌的浓度为约50μm至150μm。
18、在一个实施方案中，相对于在缺少补充剂的情况下培养的表达人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞中产生的酸性种类的百分比，所述方法还减少了人源化抗α4β7抗体的酸性种类的百分比
19、在一个实施方案中，相对于在缺少添加到生产培养基中的包含尿苷、锰和半乳本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种产生包含人源化抗α4β7抗体的组合物的方法，所述方法包括
2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法是产生包含2.5％或更少的所述人源化抗α4β7抗体的HMW种类(如通过SEC所测定)的组合物的方法。
3.一种产生包含人源化抗α4β7抗体的组合物的方法，所述方法包括
4.如权利要求3所述的方法，其中相对于在基本上类似但在所述扩增阶段与所述生产阶段之间温度不同的条件下培养的对照培养物，所述方法是产生包含高水平的所述人源化抗α4β7抗体的单体(如通过SEC所测定)的组合物的方法。
5.如权利要求3或4所述的方法，其中所述温度为36至38摄氏度。
6.如权利要求3-5所述的方法，其中所述平均温度为36.5至37.5摄氏度。
7.如权利要求3或4所述的方法，其中所述温度为约37摄氏度的平均温度。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述生产培养基的温度范围为36至38摄氏度。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述温度范围为36.5至37.5摄氏度。
10.如权利要求9
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述生产培养基的pH范围为6.5至7。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述生产培养基的pH范围为6.8至7.0。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述生产培养基的葡萄糖水平在所述生产阶段期间保持在约7g/L或更低。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述生产阶段为14天或更短。
15.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述生产阶段的范围为10天至17天。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其在大规模生物反应器中进行。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述大规模生物反应器选自由200升(L)生物反应器、2000L生物反应器、3000L和6000L生物反应器组成的组。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述生产阶段产生的所述人源化抗α4β7抗体的滴度大于3g/L。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述人源化抗α4β7抗体的滴度为约3至约8g/L。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述人源化抗α4β7抗体的滴度为约5至约7g/L。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述CHO细胞是GS-CHO细胞。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述人源化抗α4β7抗体包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO:1所列示的氨基酸序列，并且包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含如SEQ ID NO:5所列示的氨基酸序列。
24.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述人源化抗α4β7抗体是维多珠单抗。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述方法包括所述抗体的收获和纯化。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述纯化包括(i)去除任何细胞碎片、不需要的蛋白质、盐、矿物质或其他不合需要的元素的纯化步骤，和(ii)从污染物可溶性蛋白质和多肽中纯化所述抗体。
27.如权利要求25或26所述的方法，其中所述方法还包括制备适用于人类治疗用途的所述纯化抗体的药物制剂。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述药物制剂是液体药物制剂。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述液体药物制剂通过超滤/渗滤制备。
30.如权利要求27所述的方法，其中所述药物制剂是冻干的干抗体制剂。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述抗体的药物制剂是从所述纯化后通过超滤/渗滤制备的液体药物抗体制剂冻干而来的干抗体制剂。
32.一种组合物，其包含使用权利要求1-31中任一项所述的方法产生的人源化抗α4β7抗体。
33.一种包含人源化抗α4β7抗体的组合物，其中所述组合物可通过权利要求1-31中任一项所述的方法获得。
34.如权利要求32或33所述的组合物，其包含人源化抗α4β7抗体的群体，所述群体具有(i)90％或更多，或(ii)92％-95％的总去唾液酸、无半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G0F)，去唾液酸、单半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G1F)，和/或去唾液酸、二半乳糖、核...
【技术特征摘要】
1.一种产生包含人源化抗α4β7抗体的组合物的方法，所述方法包括
2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法是产生包含2.5％或更少的所述人源化抗α4β7抗体的hmw种类(如通过sec所测定)的组合物的方法。
3.一种产生包含人源化抗α4β7抗体的组合物的方法，所述方法包括
4.如权利要求3所述的方法，其中相对于在基本上类似但在所述扩增阶段与所述生产阶段之间温度不同的条件下培养的对照培养物，所述方法是产生包含高水平的所述人源化抗α4β7抗体的单体(如通过sec所测定)的组合物的方法。
5.如权利要求3或4所述的方法，其中所述温度为36至38摄氏度。
6.如权利要求3-5所述的方法，其中所述平均温度为36.5至37.5摄氏度。
7.如权利要求3或4所述的方法，其中所述温度为约37摄氏度的平均温度。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述生产培养基的温度范围为36至38摄氏度。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述温度范围为36.5至37.5摄氏度。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述温度为约37摄氏度的平均温度。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述生产培养基的ph范围为6.5至7。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述生产培养基的ph范围为6.8至7.0。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述生产培养基的葡萄糖水平在所述生产阶段期间保持在约7g/l或更低。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述生产阶段为14天或更短。
15.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述生产阶段的范围为10天至17天。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其在大规模生物反应器中进行。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述大规模生物反应器选自由200升(l)生物反应器、2000l生物反应器、3000l和6000l生物反应器组成的组。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述生产阶段产生的所述人源化抗α4β7抗体的滴度大于3g/l。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述人源化抗α4β7抗体的滴度为约3至约...
【专利技术属性】
技术研发人员：Y·K·戈塔姆，S·S·莱，E·G·斯卡弗，N·维什瓦纳坦，
申请(专利权)人：武田药品工业株式会社，
类型：发明
国别省市：
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