【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，特别是涉及一种egfr突变检测用试剂盒、构建方法及验证方法。
技术介绍
1、目前，针对egfr的c790顺式和反式的检测方法主要包括：数字pcr法、荧光定量pcr法和二代测序法(ngs)，这几种方法分别具有以下特点：
2、(一)数字pcr法：该方法通过对设计t790m和797所有对应突变的特异性荧光探针，根据位点的荧光信号判定反式或顺式；但是，该方法需要对所有的变异都设计特异性的探针，太多的探针混合会造成非特异性扩增及高噪音，影响结果的判定；
3、(二)荧光定量pcr法：该方法通过不同的arms引物或阻遏探针的搭配组合来区分检测，进而判断检测结果为顺式或反式；但是，此方法需要多管操作，且需要不加阻遏探针组做对照，操作繁琐；
4、(三)二代测序法(ngs)；该方法的测序结果可以直观的看出在同一条模板上egfr790和797位置的碱基情况，从而推测顺式或反式；但是，该方法的耗时长、成本高和对人员操作技术要求高，普适性较差。
5、在上述现有方法中，ngs是唯一能够直接通过序列信息来明确辨别c797s和t790m的顺反式突变构型的高灵敏度高特异性检测方法，而其他的pcr技术(如arms pcr或者数字pcr)，只能通过单点检测的荧光信号间接推测突变构型，不能提供序列信息，无法对构型做出准确无争议的直接判断；然而，ngs技术虽然通量大、精确度高以及信息量丰富，但是ngs的用时长、实验仪器和流程复杂、成本高且难以满足所有病人的检测需求。
6、综上所述，现有技术中
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于，提供一种egfr突变检测用试剂盒、构建方法及验证方法，进而解决现有技术中存在的上述所有问题或问题之一。
2、为解决上述技术问题，本专利技术的具体技术方案如下：
3、一方面，本专利技术提供一种egfr突变检测用试剂盒，包括：
4、用于检测egfr顺式突变以及反式突变的引物探针组合；
5、所述引物探针组合，包括：dsn-blocker混合物以及引物探针混合物。
6、作为一种改进的方案，所述dsn-blocker混合物，由e-t790-b1和e-t797-b1组成；
7、或，
8、所述dsn-blocker混合物，由e-t790-b2和e-t797-b2组成。
9、作为一种改进的方案，所述引物探针混合物的组分，包括：正向引物e-c797s-1f1、正向引物e-c797s-2f1、反向引物e-790-797-r1和检测探针e-t790m-p1；
10、所述正向引物e-c797s-1f1、所述正向引物e-c797s-2f1、所述反向引物e-790-797-r1和所述检测探针e-t790m-p1的浓度比为2:2:2:1；
11、或，
12、所述引物探针混合物的组分，包括：正向引物e-c797s-1f2、正向引物e-c797s-2f2、反向引物e-790-797-r2和检测探针e-t790m-p2；
13、所述正向引物e-c797s-1f2、所述正向引物e-c797s-2f2、所述反向引物e-790-797-r2和所述检测探针e-t790m-p2的浓度比为2:2:2:1。
14、作为一种改进的方案，所述引物探针混合物，还包括：内参基因in-f、内参基因in-r和内参基因in-p；
15、所述内参基因in-f、所述内参基因in-r和所述内参基因in-p的浓度比为2:2:1；
16、所述in-f的序列信息为：gctaagtcctgccctcattt；
17、所述in-r的序列信息为：gtacaggtctttgcggatgt；
18、所述in-p的序列信息为：5’hex-agtttcgtggatgccacaggactc-3’mgb。
19、作为一种改进的方案，所述e-t790-b1的序列信息为：p-catgagctgcg tgatgag-3’mgb；
20、所述e-t797-b1的序列信息为：p-gtccaggaggcagccgaaggg-3’mg b；
21、所述e-t790-b2的序列信息为：p-atgagctgcgtgatgagct-3’mgb；
22、所述e-t797-b2的序列信息为：p-gtccaggaggcagccgaagg-3’mgb。
23、作为一种改进的方案，所述e-c797s-1f1的序列信息为：ccggacatagtccaggagact；
24、所述e-c797s-2f1的序列信息为：ccggacatagtccaggacgg；
25、所述e-790-797-r1的序列信息为：cacgtgtgccgcctgct；
26、所述e-t790m-p1的序列信息为：5’fam-aagggcatgagctgcatgatg ag-3’mgb；
27、所述e-c797s-1f2的序列信息为：ccggacatagtccaggaggct；
28、所述e-c797s-2f2的序列信息为：ccggacatagtccaggaggg；
29、所述e-790-797-r2的序列信息为：ttcacgtgtgccgcctgctg；
30、所述e-t790m-p2的序列信息为：5’fam-tagggcatgagctgcatgatgag-3’mgb。
31、另一方面，本专利技术还提供一种egfr突变检测用试剂盒的构建方法，用于构建所述的egfr突变检测用试剂盒，所述构建方法包括以下步骤：
32、确定突变位点的正向序列信息和反向序列信息；
33、根据所述反向序列信息设置第一引物探针组以及第二引物探针组。
34、另一方面，本专利技术还提供一种egfr突变检测用试剂盒的验证方法，用于验证所述的egfr突变检测用试剂盒，所述验证方法包括以下步骤：
35、选取阳性标准品，对所述阳性标准品进行预处理；
36、采用所述egfr突变检测用试剂盒对所述预处理后的标准品依次进行dsn反应以及pcr反应，并对结果进行判读。
37、作为一种改进的方案，所述dsn反应的反应体系，包括：
38、10x dsn缓冲液，1.5μl；
39、dna模板，5μl；
40、2.5μm dsn-blocker混合物，1μl；
41、超纯水，补水至14.75μl；
42、所述dsn反应的反应程序，包括：
43、98℃，降温至65～67℃，加入0.25μldsn酶；
44、65～67℃，20min，孵育；
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1.一种EGFR突变检测用试剂盒，其特征在于，包括：用于检测EGFR顺式突变以及反式突变的引物探针组合；
2.根据权利要求1所述的EGFR突变检测用试剂盒，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的EGFR突变检测用试剂盒，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的EGFR突变检测用试剂盒，其特征在于：
5.根据权利要求2所述的EGFR突变检测用试剂盒，其特征在于：
6.根据权利要求3所述的EGFR突变检测用试剂盒，其特征在于：
7.一种EGFR突变检测用试剂盒的构建方法，用于构建权利要求1中所述的EGFR突变检测用试剂盒，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
8.一种EGFR突变检测用试剂盒的验证方法，用于验证权利要求1中所述的EGFR突变检测用试剂盒，其特征在于，所述验证方法包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的EGFR突变检测用试剂盒的验证方法，其特征在于：
10.根据权利要求9所述的EGFR突变检测用试剂盒的验证方法，其特征在于：
【技术特征摘要】
1.一种egfr突变检测用试剂盒，其特征在于，包括：用于检测egfr顺式突变以及反式突变的引物探针组合；
2.根据权利要求1所述的egfr突变检测用试剂盒，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的egfr突变检测用试剂盒，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的egfr突变检测用试剂盒，其特征在于：
5.根据权利要求2所述的egfr突变检测用试剂盒，其特征在于：
6.根据权利要求3所述的egfr突变检测用试剂盒，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶绍云，杨小娟，刘雨，马金鑫，
申请(专利权)人：健路生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：
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