【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶工程，具体是一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体及其制备方法和应用。
技术介绍
1、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,g6pdh)是一种以nad+或nadp+为辅酶的氧化还原酶，催化底物葡萄糖-6-磷酸生成6-磷酸葡萄糖-δ-内酯，反应中需要nad+或nadp+作为电子受体，并形成还原型nadh或者nadph。现有大量研究证明g6pdh广泛存在于高等动物、植物和真菌等真核生物细胞，而且也存在于一些原核细胞中。通常真核来源的g6pdh严格以nadp+为电子受体，以nad+作为电子受体时的km要比以nadp+时的大1000倍。然后有些原核生物的g6pdh可以同时利用nadp+和nad+作为电子受体。
2、目前，g6pdh被广泛用于nad+(nadp+)和葡萄糖-6-磷酸的酶法测定，也被用于磷酸葡萄糖异构酶、磷酸葡萄糖变位酶和己糖激酶活性的测定。另外，g6pdh和己糖激酶联用可用于临床检验中血糖的测定。不同物种来源的g6pdh结构存在差异，大多数以同源二聚体和四聚体的形式存在，单亚基分子量一般在40-70kda之间。不同物种来源的g6pdh催化底物葡萄糖-6-磷酸的km值也相差较大，从几十微摩尔到超过几千微摩尔。另外，不同物种来源g6pdh的比活性、热稳定性、ph稳定性以及金属离子耐受性均有较大差异。
3、目前，临床检测中广泛使用的g6pdh来源于肠膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)，该酶可以利用nadp+和nad
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体及其制备方法和应用，在与野生酶相比t412w突变酶的比活性没有显著变化的前提下，能够显著提高葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的热稳定性。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、本专利技术提供一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体以氨基酸序列如seq id no.1序列为亲本；所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶亲本第364位的谷氨酸突变为脯氨酸，或第412位的苏氨酸发生突变为色氨酸。
4、序列表seq id no.1为：
5、mvseiktlvtffggtgdlakrklypsvfnlykkgylqkhfaivgtarqalnddefkqlvrdsikdftddqaqaeafiehfsyrahdvtdaasyavlkeaieeaadkfdidgnrifymsvaprffgtiakylkseglladtgynrlmiekpfgtsydtaaelqndlenafddnqlfridhylgkemvqniaalrfgnpifdaawnkdyiknvqvtlsevlgveeragyydtagalldmiqnhtmqivgwlamekpesftdkdiraaknaafnalkiydeaevnkyfvraqygagdsadfkpyleeldvpadsknntfiagelqfdlprwegvpfyvrsgkrlaakqtrvdivfkagtfnfgseqeaqeavlsiiidpkgaielklnaksvedafntrtidlgwtvsdedkkntpepyermihdtmngdgsnfadwngvsiawkfvdaisavytadkapletyksgsmgpeasdkllaangdawvfkg
6、上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体中，编码权利要求1所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶亲本的编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
7、序列表seq id no.2为：
8、atggtttctgaaatcaaaaccctggttaccttcttcggtggtaccggtgatctggcgaaacgtaaactgtacccgagcgttttcaacctgtacaaaaaaggttacctgcagaaacacttcgcgatcgttggcaccgcgcgtcaggcgctgaacgatgatgaattcaaacagctggttcgtgactccatcaaagatttcactgatgatcaggcgcaggctgaagcgttcatcgaacacttcagctaccgtgcgcatgatgttaccgacgcggcatcctacgcagttctgaaagaagcaatcgaagaagcggcggacaaattcgatatcgatggtaaccgtatcttctacatgagcgttgcgccgcgtttctttggcaccatcgccaaatacctgaaaagcgaaggcctgctggcggataccggttacaaccgcctgatgatcgaaaaaccgtttggcactagctacgacaccgcagcggaactgcagaacgatctggaaaacgctttcgatgataaccagctgttccgcatcgatcactacctgggcaaagaaatggttcagaacatcgcggccctccgttttggcaacccgatcttcgatgctgcctggaacaaagattacattaaaaacgttcaggtgaccctgtctgaagttctgggtgtggaagaacgtgcgggctactatgataccgcgggcgctctgctggatatgatccagaaccacaccatgcagattgttggctggctggcgatggaaaaaccggaatctttcaccgataaagacatccgtgcggcgaaaaacgctgcgttcaacgctctgaaaatctacgacgaagcggaagttaacaaatacttcgttcgtgcacagtacggcgcgggtgattctgctgatttcaaaccgtatctggaagaactggatgttccggctgactctaaaaacaacaccttcatcgctggcgaactgcagttcgatctgccgcgttgggaaggtgttccgttctatgtgcgttctggtaaacgtctggcggcgaaacagacccgtgttgatatcgttttcaaagctggcaccttcaacttcggtagcgaacaggaagcacaggaagcagtgctgagcatcattatcgacccgaaaggtgcgattgaactgaaactgaacgcgaa本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体以氨基酸序列如SEQ ID NO.1序列为亲本；所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶亲本第364位的谷氨酸突变为脯氨酸，或第412位的苏氨酸发生突变为色氨酸。
2.根据权利要求1所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体，其特征在于，编码权利要求1所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶亲本的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体基因重组质粒的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求1所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体，其特征在于，还包括表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶重组质粒的宿主细胞，所述宿主细胞的宿主为大肠杆菌。
5.根据权利要求4所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述基因重组质粒的表达载体包括但不限于pET系列、pETDuet系列或pACYC系列；pET系列载体还包括pET-28a(
6.一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体的制备方法，其特征在于，制备权利要求1至5任一权利要求所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体，包含如下步骤:
7.一种提高葡萄糖-6-磷酸脱氢酶热稳定性的方法，其特征在于，氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶第364位的谷氨酸突变为脯氨酸，或第412位的苏氨酸发生突变为色氨酸。
8.一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体在制备临床体外诊断试剂中的应用，其特征在于，采用权利要求1至5任一权利要求所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体。
...【技术特征摘要】
1.一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体以氨基酸序列如seq id no.1序列为亲本；所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶亲本第364位的谷氨酸突变为脯氨酸，或第412位的苏氨酸发生突变为色氨酸。
2.根据权利要求1所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体，其特征在于，编码权利要求1所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶亲本的编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
3.根据权利要求1所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体基因重组质粒的核苷酸序列分别如seq id no.3和seq id no.4所示。
4.根据权利要求1所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体，其特征在于，还包括表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶重组质粒的宿主细胞...
【专利技术属性】
技术研发人员：牛卫宁，叶建舟，王岩雄，姜山峰，高山，胡舒心，王军，甘海胜，李恒，
申请(专利权)人：西北工业大学，
类型：发明
国别省市：
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