【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白质加工，具体涉及一种高纯度肌酸激酶同工酶ckmm的纯化方法。
技术介绍
1、肌酸激酶(creatine kinase，ck)，也称为肌酸磷酸激酶，广泛存在于各种组织中，与三磷酸腺苷(atp)的再生有关，此酶的功能是在生理水平上维持细胞内的三磷酸腺苷浓度。它的催化作用是可逆的，即将高能磷酸键从磷酸肌酸转移至二磷酸腺苷(adp)上或从三磷酸腺苷上将高能磷酸键转移至肌酸，形成磷酸肌酸。
2、肌酸激酶以骨骼肌、心肌、平滑肌含量为多，其次是脑组织，胃肠道、肺和肾内含量较少。肌酸激酶主要存在于细胞质和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、atp再生有直接关系的重要激酶。肌酸激酶是由b、m两种不同亚基组成了三种同工酶即ckmm、ckmb、ckbb。ckbb主要存在于脑组织、胃肠道、前列腺及子宫平滑肌中，脑组织中几乎全为ckbb，ckmb主要存在于心肌组织中，ckmm主要存在于骨骼肌组织中，正常人血液中大部分是ck-mm，少量ck-mb，而ck-bb极少。
3、肌酸激酶的同功酶在临床诊断中有十分重要的意义，在各种病变包括肌肉萎缩和心肌梗塞发生时，人的血清中肌酸激酶水平迅速提高，目前认为在心肌梗塞的诊断中测定肌酸激酶的活性比做心电图更为可靠。心肌梗死时，肌酸激酶在起病6小时内升高，24小时达高峰，3-4日内恢复正常。肌酸激酶因其具有重要的生理功能和临床应用价值已引起人们广泛的重视和深入的研究。
4、目前很多试剂配套标准品中需要添加高纯度的肌酸激酶，大多数都是从临床找高值患者血清样本，找到
5、cn116640741a公开了一种从牛血清中提取肌酸激酶的方法，包括以下步骤，取新鲜牛血，离心取牛血清，用纱布过滤，再用4微米的过滤膜过滤，得到酶粗液加入atp作为保护剂，用生化分析仪和相应诊断试剂检测酶粗液中的肌酸激酶和丙氨酸氨基转移酶的含量，记录测试值。该方法从牛血清中提取肌酸激酶，纯化，保存等一系列操作，并建立了检测和评估方法，从新鲜牛血到最后得到肌酸激酶纯品的过程中，对肌酸激酶和丙氨酸氨基转移酶同时进行监测，随着提纯的不断进行，丙氨酸氨基转移酶不断降低肌酸激酶逐步升高，最终达到丙氨酸氨基转移酶测试值为0，肌酸激酶含量达到1000u/l以上，得到肌酸激酶的纯品。
6、cn103014034a公开了一种制备肌酸激酶同工酶的方法及应用，该方法包括：改造全基因合成人源化肌酸激酶同工酶编码基因序列，去除大肠杆菌稀有密码子；将改造后的肌酸激酶同工酶编码基因序列插入表达载体中，并用大肠杆菌菌株转化表达；将转化表达菌株接种于lb培养基，iptg诱导；所得菌体破菌，离心分离，过ni-nta柱纯化；该方法制备肌酸激酶同工酶操作非常简单，制备成本低，成品产率高，纯度高而且具有高生物活性，作为抗原物质可进行动物免疫，筛选相关抗体，同时为尽快建立国内临床化学诊断急需的校准品制备平台，研制诊断试剂标准物质和参考品奠定基础。
7、因此，开发一种可以制备高纯度肌酸激酶同工酶，并且操作简便、高效的方法，是本领域的研究重点。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种高纯度肌酸激酶同工酶ckmm的纯化方法。
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种高纯度肌酸激酶同工酶ckmm的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括如下步骤：
4、(1)采用氨水对ckmm粗体液进行透析，透析完成后进行离心，收集上清液样品；
5、(2)将所述上清液样品采用弱阴离子交换柱进行一次层析纯化，梯度洗脱后收集目标洗脱样品；
6、(3)将所述目标洗脱样品采用复合型弱阴离子交换柱进行二次层析纯化，梯度洗脱后收集目标样品，即为高纯度肌酸激酶同工酶ckmm。
7、优选地，所述氨水中nh3的浓度为1.5-2mm，例如可以为1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm等，优选为1.75mm。
8、优选地，所述透析采用的透析袋孔径为14kda，例如可以为
9、优选地，所述透析包括一次透析和二次透析。
10、优选地，所述一次透析的温度为3-5℃，例如可以为3.5℃、4℃、4.5℃等，时间为10-15h，例如可以为11h、12h、13h、14h等。
11、优选地，所述二次透析的温度为3-5℃，例如可以为3.5℃、4℃、4.5℃等，时间为4-5h，例如可以为4.3h、4.5h、4.8h等。
12、优选地，所述弱阴离子交换柱为deae柱。
13、优选地，所述一次层析纯化采用的洗脱剂中包含缓冲液和氯化钠。
14、优选地，所述洗脱剂的ph为7.2-8.8，例如可以为7.4、7.6、7.8、8、8.2、8.4、8.6等。
15、优选地，所述缓冲液为tris-hcl。
16、优选地，所述洗脱剂中缓冲液的浓度为18-22mm，例如可以为19mm、20mm、21mm等，优选为20mm。
17、优选地，所述洗脱剂中氯化钠的浓度为20-200mm，例如可以为40mm、60mm、80mm、100mm、120mm、140mm、160mm、180mm等。
18、优选地，所述目标洗脱样品为收集洗脱剂中氯化钠浓度为20-50mm时的洗脱峰得到。
19、优选地，所述复合型弱阴离子交换柱为mmc柱。
20、优选地，所述二次层析纯化采用的洗脱剂中包含缓冲液和氯化钠。
21、优选地，所述洗脱剂的ph为5.5-6.5，例如可以为5.6、5.8、6、6.2、6.4等。
22、优选地，所述缓冲液为mes。
23、优选地，所述洗脱剂中缓冲液的浓度为10-40mm，例如可以为15mm、20mm、25mm、30mm、35mm等。
24、优选地，所述洗脱剂中氯化钠的浓度为50-500mm，例如可以为60mm、80mm、100mm、150mm、200mm、250mm、300mm、350mm、400mm、450mm等。
25、优选地，所述高纯度肌酸激酶同工酶ckmm为收集洗脱剂中氯化钠浓度为150-300mm时的洗脱峰得到。
26、优选地，所述纯化方法包括如下步骤：
27、(1)采用1.5-2mm的氨水对ckmm粗体液进行2次透析，透析袋的孔径为14kda，一次透析的温度为3-5℃，时间为10-15h，二次透析的温度为3-5℃，时间为4-5h，透析完成后进行离心，收集上清液样品；
28、(2)将所述上清液样品采用deae弱阴离子交换柱进行一次层析纯化，洗脱剂中包含18-22mm缓冲液tris-hcl和20-2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高纯度肌酸激酶同工酶CKMM的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述氨水中NH3的浓度为1.5-2mM，优选为1.75mM。
3.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，所述透析采用的透析袋孔径为14kDa；
4.根据权利要求1-3任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述弱阴离子交换柱为DEAE柱；
5.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，所述缓冲液为Tris-HCl；
6.根据权利要求1-5任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述复合型弱阴离子交换柱为MMC柱；
7.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，所述缓冲液为MES；
8.根据权利要求1-7任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括如下步骤：
9.一种高纯度肌酸激酶同工酶CKMM，其特征在于，所述高纯度肌酸激酶同工酶CKMM采用如权利要求1-8任一项所述的纯化方法制备得到。
10.一种如权利要求9所述的高纯度肌酸激酶同工酶CK
...【技术特征摘要】
1.一种高纯度肌酸激酶同工酶ckmm的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述氨水中nh3的浓度为1.5-2mm，优选为1.75mm。
3.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，所述透析采用的透析袋孔径为14kda；
4.根据权利要求1-3任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述弱阴离子交换柱为deae柱；
5.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，所述缓冲液为tris-hcl；
...
【专利技术属性】
技术研发人员：兰山，王佑富，孙宇鹏，周娇娇，隋相坤，
申请(专利权)人：深圳太古语科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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