【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于荧光探针，具体涉及体外快速检测γ-谷氨酰转肽酶的吡啶类荧光探针及其制备方法和应用。
技术介绍
1、癌症作为重大公共卫生问题之一，严重威胁着全球人口的健康。为了及时发现和治疗癌症，我们必须开发癌症的早期诊断方法。肿瘤标志物是由肿瘤细胞直接产生或由非肿瘤细胞通过肿瘤细胞诱导的特征物质，对癌症早期筛查具有实际意义。
2、γ-谷氨酰转肽酶作为肿瘤标志物之一，已被证明与许多疾病密切相关，如恶性肿瘤、糖尿病和耐药性等。它是一种细胞表面相关酶，可以调节细胞内γ-谷氨酰(γ-glu)、谷胱甘肽(gsh)和半胱氨酸(cys)的稳态。γ-谷氨酰转肽酶在肝脏、颈部和卵巢肿瘤等几种恶性肿瘤的细胞表面过表达。此外，研究还发现γ-谷氨酰转肽酶通过细胞氧化应激对内外环境的有害刺激作出反应而上调。
3、迄今为止，对γ-谷氨酰转肽酶的检测主要依赖色谱法、电化学发光法、表面增强共振拉曼散射方法、比色法等手段。但上述方法都需要复杂的仪器，且操作繁琐。荧光探针由于具有分辨率高和细胞兼容性好等特点目前已成为肿瘤标志物检测的有效替代方法。其中，有机荧光探针在肿瘤标志物的检测中备受关注(li,x.；yin,c.；zhang,l.；huo,f.,dyesandpigments.2023,219,111631.)。近年来，γ-谷氨酰转肽酶的检测主要围绕花菁类(gui,l.；li,w.；pan,y.；zhao,j.；kong,x.；liu,j.；zuo,k.；yan,j.；ling,y.；ling,c.；li,r.；yuan,z.,sens.
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供体外快速检测γ-谷氨酰转肽酶的吡啶类荧光探针及其制备方法和应用，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、本专利技术的目的是通过下述技术方案予以实现：体外快速检测γ-谷氨酰转肽酶的吡啶类荧光探针，包括荧光探针py-ggt-1，所述荧光探针的结构式为：
3、
4、外快速检测γ-谷氨酰转肽酶的吡啶类荧光探针的制备方法，包括荧光探针(py-ggt-1)以(e)-4-苯乙烯基吡啶片段为荧光信号报告基团，以苯胺修饰荧光基团，通过氨基与羧基的缩合反应引入叔丁氧羰基-l-谷氨酸1-叔丁脂，用三氟乙酸脱去boc保护基后作为γ-谷氨酰转肽酶的酶切位点。
5、体外快速检测γ-谷氨酰转肽酶的吡啶类荧光探针的制备方法，具体包括如下步骤：
6、第一步，以1,4-二氧六环和水为反应介质，在氩气氛围中以2-溴-4-氯吡啶和(4-((叔丁氧羰基)氨基)苯基)硼酸为反应物，以四(三苯基膦钯)为催化剂，以碳酸钠为反应用碱，85℃回流反应12h，反应完毕后，经水萃取后通过200-300目硅胶柱层析分离，以乙酸乙酯/石油醚为洗脱剂，得到白色固体(4-(4-氯吡啶-2-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯；
7、第二步，以二氯甲烷作为反应介质，将步骤(一)得到的(4-(4-氯吡啶-2-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯用二氯甲烷溶解，向二氯甲烷溶液中缓慢滴加三氟乙酸，室温下搅拌直至反应完毕，之后减压蒸馏除去溶剂和大部分三氟乙酸，加入饱和碳酸氢钠水溶液调节碱性环境，经水萃取后通过200-300目硅胶柱层析分离，以乙酸乙酯/石油醚为洗脱剂，得到白色固体4-(4-氯吡啶-2-基)苯胺；
8、第三步，将叔丁氧羰基-l-谷氨酸1-叔丁脂(boc-glu-otbu)，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)，n,n-二异丙基乙胺(dipea)，溶解于dmf中，在室温下搅拌15min，加入4-(4-氯吡啶-2-基)苯胺的dmf溶液，室温下反应24h，反应完毕后，经水萃取后通过200-300目硅胶柱层析分离，以乙酸乙酯/石油醚为洗脱剂，得到白色固体n2-(叔丁氧羰基)-n5-(4-(4-氯吡啶-2-基)苯基)谷氨酸叔丁酯；
9、第四步，以1,4-二氧六环和水为反应介质，氩气氛围中以n2-(叔丁氧羰基)-n5-(4-(4-氯吡啶-2-基)苯基)谷氨酸叔丁酯和(e)-苯乙烯硼酸为反应物，以四(三苯基膦)钯为催化剂，以碳酸钠为反应用碱，105℃回流反应12h，反应完毕后，经水萃取后通过200-300目硅胶柱层析分离，以乙酸乙酯/石油醚为洗脱剂，得到白色固体(e)-n2-(叔丁氧羰基)-n5-(4-(4-苯乙烯基吡啶-2-基)苯基)谷氨酸叔丁酯；
10、第五步，以二氯甲烷为反应介质，将(e)-n2-(叔丁氧羰基)-n5-(4-(4-苯乙烯基吡啶-2-基)苯基)谷氨酸叔丁酯溶解于二氯甲烷中，缓慢滴入用二氯甲烷稀释过的三氟乙酸，室温下反应6h，反应完毕后减压蒸馏除去溶剂，通过c18柱分离，以甲醇/水为洗脱剂，得到吡啶类目标荧光探针。
11、进一步地，所述2-溴-4-氯吡啶与4-((叔丁氧羰基)氨基)苯基)硼酸、四(三苯基膦)钯、碳酸钠的摩尔比为1：(1.0-2.0)：(0.04-0.06)：(2.0-3.0)；
12、所述(4-(4-氯吡啶-2-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯与三氟乙酸的摩尔比为1：(13-14)。
13、进一步地，所述4-(4-氯吡啶-2-基)苯胺与boc-glu-otbu、hatu、dipea的摩尔比为1：(1.0-2.0)：(1.0-2.0)：(1.0-2.0)；
14、所述n2-(叔丁氧羰基)-n5-(4-(4-氯吡啶-2-基)苯基)谷氨酸叔丁酯与(e)-苯乙烯硼酸、四(三苯基膦)钯、碳酸钠的摩尔比为1：(1.0-2.0)：(0.04-0.06)：(2.0-3.0)；
15、所述(e)-n2-(叔丁氧羰基)-n5-(4-(4-苯乙烯基吡啶-2-基)苯基)谷氨酸叔丁酯与三氟乙酸的摩尔比为1：本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.体外快速检测γ-谷氨酰转肽酶的吡啶类荧光探针，其特征在于：包括荧光探针Py-GGT-1，所述荧光探针的结构式为：
2.根据权利要求1所述的体外快速检测γ-谷氨酰转肽酶的吡啶类荧光探针的制备方法，其特征在于：包括荧光探针(Py-GGT-1)以(E)-4-苯乙烯基吡啶片段为荧光信号报告基团，以苯胺修饰荧光基团，通过氨基与羧基的缩合反应引入叔丁氧羰基-L-谷氨酸1-叔丁脂，用三氟乙酸脱去Boc保护基后作为γ-谷氨酰转肽酶的酶切位点。
3.根据权利要求2所述的体外快速检测γ-谷氨酰转肽酶的吡啶类荧光探针的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的体外快速检测γ-谷氨酰转肽酶的吡啶类荧光探针的制备方法，其特征在于：所述2-溴-4-氯吡啶与4-((叔丁氧羰基)氨基)苯基)硼酸、四(三苯基膦)钯、碳酸钠的摩尔比为1：(1.0-2.0)：(0.04-0.06)：(2.0-3.0)；
5.根据权利要求3所述的体外快速检测γ-谷氨酰转肽酶的吡啶类荧光探针的制备方法，其特征在于，所述4-(4-氯吡啶-2-基)苯胺与Boc-Gl
6.一种根据权利要求1所述荧光探针或如权利要求2所述制备的荧光探针应用在PBS中选择性识别γ-谷氨酰转肽酶，利用合成的吡啶骨架荧光探针Py-GGT-1可对肝癌患者血清中γ-谷氨酰转肽酶进行检测。
7.一种根据权利要求1-6任意一项所述的体外快速检测γ-谷氨酰转肽酶的吡啶类荧光探针的应用，其特征在于，所述荧光探针Py-GGT-1在γ-谷氨酰转肽酶的催化酶解作用下，产生荧光微弱的代谢物Py-1-NH2，所述γ-谷氨酰转肽酶在肝癌患者体内过渡表达，合成的吡啶骨架荧光探针可对肝癌患者血清中γ-谷氨酰转肽酶进行检测。
8.根据权利要求7所述的体外快速检测γ-谷氨酰转肽酶的吡啶类荧光探针的应用，其特征在于，在γ-谷氨酰转肽酶检测中，γ-谷氨酰转肽酶与荧光探针反应的条件在37℃下于pH为7.4的PBS中共同孵育30min。
9.根据权利要求8所述的体外快速检测γ-谷氨酰转肽酶的吡啶类荧光探针的应用，其特征在于，所述荧光探针的反应浓度为10μmol·L-1。
...【技术特征摘要】
1.体外快速检测γ-谷氨酰转肽酶的吡啶类荧光探针，其特征在于：包括荧光探针py-ggt-1，所述荧光探针的结构式为：
2.根据权利要求1所述的体外快速检测γ-谷氨酰转肽酶的吡啶类荧光探针的制备方法，其特征在于：包括荧光探针(py-ggt-1)以(e)-4-苯乙烯基吡啶片段为荧光信号报告基团，以苯胺修饰荧光基团，通过氨基与羧基的缩合反应引入叔丁氧羰基-l-谷氨酸1-叔丁脂，用三氟乙酸脱去boc保护基后作为γ-谷氨酰转肽酶的酶切位点。
3.根据权利要求2所述的体外快速检测γ-谷氨酰转肽酶的吡啶类荧光探针的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的体外快速检测γ-谷氨酰转肽酶的吡啶类荧光探针的制备方法，其特征在于：所述2-溴-4-氯吡啶与4-((叔丁氧羰基)氨基)苯基)硼酸、四(三苯基膦)钯、碳酸钠的摩尔比为1：(1.0-2.0)：(0.04-0.06)：(2.0-3.0)；
5.根据权利要求3所述的体外快速检测γ-谷氨酰转肽酶的吡啶类荧光探针的制备方法，其特征在于，所述4-(4-氯吡啶-2-基)苯胺与boc-glu-otb...
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