【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因检测，具体涉及一种用于检测mglur1基因表达水平的引物组合物、试剂盒和方法。
技术介绍
1、谷氨酸(glutamate,glu)是哺乳动物中枢神经系统内含量最多的非特异性兴奋性氨基酸，glu及其受体产生的兴奋毒性和抑制细胞膜上glu/胱氨酸转运体所产生的氧化毒性，是脑缺血、脑创伤、帕金森病等的始发环节，因而glu受体已经成为这些疾病的治疗靶点之一。
2、谷氨酸受体分为两类：一类为离子型受体，包括：n-甲基-d-天冬氨酸受体(nmdar)、海人藻酸受体(kar)和α-氨基-3羟基-5甲基-4异恶唑受体(ampar)，它们与离子通道偶联，形成受体通道复合物，介导快信号传递；另一类属于代谢型受体(metabotropicglutamate receptors,mglurs)，它与膜内g-蛋白偶联，这些受体被激活后通过g-蛋白效应酶、脑内第二信使等组成的信号转导系统起作用，产生较缓慢的生理反应。mglurs可分为不同的8个亚型mglur1-8，根据氨基酸序列的同源性及其药理学特征和信号转导机制的不同，可将其分为3组，ⅰ组：mglur1、mglur5；ⅱ组：mglur2-3；ⅲ组：mglur4、mglur6-8。ⅰ组可被quis强烈活化并与磷脂酶c途径(plc)相偶联；ⅱ、ⅲ组均可与腺苷酸环化酶系统(ac)被动偶联。
3、mglur1是第一个被克隆的mglur，主要见于突触后膜，与mglur5关系密切。mglur1的激活可以诱导数条细胞内信号转导通路，包括激活磷脂酶c，使磷脂酰肌醇水解，从而升高
4、mglur1是蛛网膜下腔出血(sah)的治疗新靶点。蛛网膜下腔出血后脑脊液中存在高浓度的兴奋性神经递质—谷氨酸。过量的谷氨酸引起兴奋性毒性，进而触发钙超载和级联的细胞死亡。有研究表明tat-mglur1(ygrkkrrqrrrvikpltksyqgsgk，seq id no:9)多肽可减少葡萄糖剥夺(glucose deprivation)和缺血缺氧诱导的细胞死亡。针对高浓度谷氨酸过度激活代谢型谷氨酸受体1，采用负向变构剂来抑制代谢型谷氨酸受体1可能是有效的sah干预措施。还有研究显示心肌缺血后再灌注前5min给予glutamate，心肌缺血大小减少，dna片段也减少，glutamate治疗可改善缺血后的功能恢复，mglur1表达增加。还有研究显示mglur1还参与神经胶质瘤的增殖和进展，抑制mglur1表达可诱导细胞凋亡。大鼠是心脑血管疾病尤其是sah和脑梗常用的造模动物，因此研究mglur1的基因表达情况对心脑血管疾病及肿瘤性疾病的治疗具有重要意义。
5、对mglur1表达水平的研究除采用免疫组化和western免疫印迹等方法从蛋白水平进行研究外，也可从mrna水平研究，包括半定量反转录pcr和荧光定量pcr方法等。以蛋白为检测目标的方法通常操作比较繁琐，耗时。半定量反转录pcr需要电泳检测，准确度不够高。荧光定量pcr方法是一种高灵敏度、简便快捷的检测方法，操作简单，可应用sybr green染料法检测，无需使用荧光探针，设计简单，采用荧光定量pcr相对定量方法通过与表达水平相对稳定的管家基因比较来反映目的基因的表达水平，能很好的辅助mglur1表达水平的研究，整个pcr反应过程只需1.5小时即可完成。细胞管家基因需选择维持细胞最低限度功能所不可少的基因，在所有细胞中均要表达的一类基因，且表达水平受环境因素影响较小。细胞在应激反应时一些正常表达的基因会受到抑制，sah时存在内质网应激反应，有研究表明比较常用的actin管家基因受内质网应激影响，表达量会减少，因此不适宜用做内质网应激时的参考基因。核糖体蛋白基因产物例如rpl19是维持细胞生命活动所必须的，表达于所有细胞中，其表达只受启动序列或启动子与rna聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节，可用作应激反应的参考基因。
技术实现思路
1、为了克服现有技术中的缺陷，本专利技术提供了一种用于检测mglur1基因表达水平的引物组合物、试剂盒和方法，通过对mglur1的表达水平进行研究有助于明确疾病的发病机制和药物的疗效判断。
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术的第一方面是提供用于一种检测mglur1基因表达水平的引物组合物，包括分别靶向mglur1基因和rpl19基因的引物组；该引物组合物包括序列为seq id no:1～seqid no:4的引物。
4、本专利技术的第二方面是提供一种基于荧光定量pcr技术的包括上述引物组合物的检测mglur1基因表达水平的试剂盒。
5、进一步地，上述试剂盒还包括荧光染料，优选为sybr green荧光染料。
6、进一步地，上述试剂盒还包括用于提取rna和反转录的试剂。
7、本专利技术的第三方面是提供一种非诊断目的的采用上述试剂盒的检测mglur1基因表达水平的方法，包括如下步骤：
8、步骤1：提取样品中rna；
9、步骤2：将步骤1中提取出来的rna反转录成cdna；
10、步骤3：用荧光定量pcr法检测mglur1基因以及rpl19内参基因表达水平，并采用2-△△ct相对定量方法计算mglur1基因表达水平。
11、进一步地，步骤3采用的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火40s运行40个循环；最后40℃10s结束反应。
12、进一步地，在步骤3采用的反应体系中，各条引物的浓度为0.1～0.5μm。
13、进一步地，步骤3采用的反应体系的总体积为25μl，包括如下组分：1×acetaqsybr supermix 12.5μl，上游引物0.1～0.5μm，下游引物0.1～0.5μm，模板5μl，余量为水。
14、本专利技术的第四方面是提供上述引物组合物或试剂盒在筛选mglur1基因的干扰rna中的应用。
15、本专利技术采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
16、本专利技术提供的sybr green实时荧光定量rt-pcr方法对样品中的mglur1表达水平进行定量，其检测的灵敏度非常高，用该技术建立的试剂盒可用于特异性的检测mglur1的表达水平，操作方便简单，准确度更高，检测时间短，适合大规模推广使用。
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1.一种检测mGluR1基因表达水平的引物组合物，其特征在于，包括分别靶向mGluR1基因和RPL19基因的引物组；所述引物组合物包括序列为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4的引物。
2.一种基于荧光定量PCR技术的包括如权利要求1所述引物组合物的检测mGluR1基因表达水平的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括荧光染料，优选为SYBR Green荧光染料。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于提取RNA和反转录的试剂。
5.一种非诊断目的的采用如权利要求2-4任一项所述试剂盒的检测mGluR1基因表达水平的方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3采用的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火40s运行40个循环；最后40℃10s结束反应。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤3采用的反应体系中，各条引物的浓度为0.1～0.5μM。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征
9.如权利要求1所述的引物组合物或如权利要求2-4任一项所述试剂盒在筛选mGluR1基因的干扰RNA中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种检测mglur1基因表达水平的引物组合物，其特征在于，包括分别靶向mglur1基因和rpl19基因的引物组；所述引物组合物包括序列为seq id no:1～seq id no:4的引物。
2.一种基于荧光定量pcr技术的包括如权利要求1所述引物组合物的检测mglur1基因表达水平的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括荧光染料，优选为sybr green荧光染料。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于提取rna和反转录的试剂。
5.一种非诊断目的的采用如权利要求2-4任一项所述试剂盒的检测mglur1基因表达水平的方法，其特征在于，包括如下步骤：
<...【专利技术属性】
技术研发人员：汪锡金，靳令经，蒋明，于丽华，彭康雯，唐晓慧，黄浙学，
申请(专利权)人：上海市同济医院，
类型：发明
国别省市：
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