【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及内皮祖细胞增殖调控，具体为mirna-296-5p通过ace2信号通路对内皮祖细胞增殖的调控作用方法。
技术介绍
1、前期我们研究发现ace2通路与高血压性脑卒中发生有关，是mirna-296-5p的靶基因。本研究拟探究通过mirna-mrna的调控模式继续深入探究mir-296-5p调节epcs增殖的作用机制以及mir-296-5p/ace2异位表达的epcs对高血压性脑卒中的治疗作用。
2、(1)选择mir-296-5p作为研究对象，拟进一步探究mir-296-5p/ace2轴在高血压并发急性脑卒中的表达相关性。并通过roc曲线和auc面积分析mir-296-5p成为判断高血压并发脑卒中的生物标志物的特异性和敏感性；
3、(2)拟通过靶向结合验证实验验证mir-296-5p/ace2的靶向关系，深入探究mir-296-5p/ace2信号轴调节epcs增殖的分子机制，以及mir-296-5p/ace2异位表达的epcs对高血压性脑卒中的治疗作用。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供mirna-296-5p通过ace2信号通路对内皮祖细胞增殖的调控作用方法，以解决上述
技术介绍
中提出的技术问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：mirna-296-5p通过ace2信号通路对内皮祖细胞增殖的调控作用方法，包括如下步骤：
3、s1：临床实验；
4、s11：确定研究对象；
5、s1
6、s13：观察指标与方法：
7、①qrt-pcr法：通过trizol法提取各组样本的总rna；②酶联免疫吸附试验(elisa)：用elisa测定各组患者血清ang-(1-7)的表达水平，反应中止后，采用酶标仪测量450nm处的od值；③根据患者的临床病理资料，spearman相关性分析mir-296-5p与临床病理参数(年龄，性别，吸烟饮酒史等)的相关性；④绘制受试者工作特征曲线(roc曲线)和曲线下面积(auc)分析患者中mir-296-5p的表达情况，评价mir-296-5p作为高血压性脑卒中诊断标志物的特异性和敏感性。
8、s2：细胞实验；
9、s21：epcs细胞分离、培养；
10、s22：epcs细胞鉴定：
11、①记录不同情况下细胞的形态、生长、增殖情况；②用流式细胞仪分析处理后的epcs；
12、s23：载体构建及细胞转染；
13、s24：指标检测：
14、1)靶向性验证：①双荧光素酶报告基因实验；②原位荧光杂交(fish)；
15、2)mir-296-5p在高血压性脑卒中患者epcs中的表达情况：①qrt-pcr法：检测步骤同上；②westernblot法：检测脑组织和血清中epcs内ace2、mas的蛋白表达水平；③elisa法：检测步骤同上；
16、3)mir-296-5p调节epcs增殖的机制研究：①cck8实验；②细胞划痕实验；③transwell小室实验；④annexinv-fitc/pi双染法结合流式细胞术；⑤qrt-pcr法：检测步骤同上；⑥免疫荧光法检测；⑦elisa法：检测步骤同上。
17、s3：载体构建及细胞转染；
18、s31：确定实验动物；
19、s32：高血压动物模型构建；
20、s33：tmcao模型构建；
21、s34：epcs注射及实验分组；
22、s35：行为学实验：①神经功能评估；②平衡木行走试验；
23、s36：分子生物学实验：①ttc染色检测；②ttc染色检测；③免疫组织化学；④qrt-pcr法：检测步骤同上；⑤westernblot法：检测步骤同上；⑥elisa法：检测步骤同上。
24、s4：统计学分析。
25、优选的，所述s11中选取收治的高血压并发急性脑卒中患者(研究组)和在我院的同期健康体检者(对照组)作为研究对象。
26、优选的，所述s12中独立样本计算公式公式中n为所需样本例数，s为总体标准差的估计值，一般假设其相等或者取合并方差的平方根，δ为两均数之差值，tα/2和tβ/2分别为检查水准α和第ⅱ型错误概率β所对应的t值，双侧α＝0.05，β＝0.1，查表得tα/2＝1.96，tβ/2＝1.282，前期预实验δ＝5.4，s＝8.78，带入公式经计算，n＝56。
27、优选的，所述qrt-pcr法检测的反应条件：75℃预变性，2min，进入以下循环90℃变性，5min；60℃退火，60s；72℃延伸，30s；共40个循环，相对表达量用2-δδct表示，每组实验设置3次重复。
28、优选的，所述westernblot法的检测步骤：首先收集各组细胞，pbs清洗3次后，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行裂解提取总蛋白，等量蛋白进行sds-page凝胶电泳分离后转至pvdf膜；然后用5％的bsa进行封闭，再依次孵育相应的一抗和二抗；最后进行显色并统计灰度值计算相对表达量。
29、优选的，所述s21中取两组研究对象肘静脉血20ml，用1/2体积的pbs溶液稀释混匀，按1:1比例将淋巴细胞分离液和稀释血加入50ml试管中，经处理培养后继续传代或实验用。
30、优选的，所述s22中的①在激光共聚焦显微镜不同放大倍数下观察不同代数细胞的形态、生长、增殖情况，并使用照相系统进行拍照记录。
31、优选的，所述s22中的②将epcs消化，重悬于pbs中，调整细胞数量至1×105/管；将荧光素标记的流式抗体加入细胞中，室温避光孵育30分钟；离心5分钟；弃上清，将细胞沉淀重悬于pbs中；用流式细胞仪进行分析，根据标记组合，定义cd133+、cd34+为epcs。
32、优选的，所述s24中的①将各组细胞以细胞密度为2,000个/孔细胞置于96孔板中，每隔24h更换一次培养基(10％cck-8溶液)，分别取5个时间点(0h，24h，48h，72h，96h)，每个时间点设置3次重复，使用酶标仪检测490nm双波长的od值。
33、优选的，所述s4中采用spss20.0统计软件对所得数据进行分析；定量资料用均数±标准差表示，分类变量用百分数表示，定量资料满足正态分布并且方差齐的两组组间比较采用t检验，多组比较采用方差分析；分类变量的多组比较采用pearson卡方检验或fisher确切概率法；应用roc曲线进行敏感度和特异性分析；p＜0.05为差异有统计学意义。
34、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
35、1.本专利技术探究mir-296-5p/ace2轴在高血压并发急性脑卒中患者中的表达相关性以及评价mir-296-5p成为判断高血压并发脑卒中的生物标志物的特异性和敏感性。
36、2.本专利技术探究mir-296-5p/ace本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.miRNA-296-5p通过ACE2信号通路对内皮祖细胞增殖的调控作用方法，其特征在于：包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的miRNA-296-5p通过ACE2信号通路对内皮祖细胞增殖的调控作用方法，其特征在于：所述S11中选取收治的高血压并发急性脑卒中患者(研究组)和在我院的同期健康体检者(对照组)作为研究对象。
3.根据权利要求1所述的miRNA-296-5p通过ACE2信号通路对内皮祖细胞增殖的调控作用方法，其特征在于：所述S12中独立样本计算公式公式中N为所需样本例数，S为总体标准差的估计值，一般假设其相等或者取合并方差的平方根，δ为两均数之差值，tα/2和tβ/2分别为检查水准α和第Ⅱ型错误概率β所对应的t值，双侧α＝0.05，β＝0.1，查表得tα/2＝1.96，tβ/2＝1.282，前期预实验δ＝5.4，S＝8.78，带入公式经计算，N＝56。
4.根据权利要求1所述的miRNA-296-5p通过ACE2信号通路对内皮祖细胞增殖的调控作用方法，其特征在于：所述qRT-PCR法检测的反应条件：75℃预变性，2min，进入以下
5.根据权利要求1所述的miRNA-296-5p通过ACE2信号通路对内皮祖细胞增殖的调控作用方法，其特征在于：所述Westernblot法的检测步骤：首先收集各组细胞，PBS清洗3次后，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行裂解提取总蛋白，等量蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离后转至PVDF膜；然后用5％的BSA进行封闭，再依次孵育相应的一抗和二抗；最后进行显色并统计灰度值计算相对表达量。
6.根据权利要求1所述的miRNA-296-5p通过ACE2信号通路对内皮祖细胞增殖的调控作用方法，其特征在于：所述S21中取两组研究对象肘静脉血20ml，用1/2体积的PBS溶液稀释混匀，按1:1比例将淋巴细胞分离液和稀释血加入50ml试管中，经处理培养后继续传代或实验用。
7.根据权利要求1所述的miRNA-296-5p通过ACE2信号通路对内皮祖细胞增殖的调控作用方法，其特征在于：所述S22中的①在激光共聚焦显微镜不同放大倍数下观察不同代数细胞的形态、生长、增殖情况，并使用照相系统进行拍照记录。
8.根据权利要求1所述的miRNA-296-5p通过ACE2信号通路对内皮祖细胞增殖的调控作用方法，其特征在于：所述S22中的②将EPCs消化，重悬于PBS中，调整细胞数量至1×105/管；将荧光素标记的流式抗体加入细胞中，室温避光孵育30分钟；离心5分钟；弃上清，将细胞沉淀重悬于PBS中；用流式细胞仪进行分析，根据标记组合，定义CD133+、CD34+为EPCs。
9.根据权利要求1所述的miRNA-296-5p通过ACE2信号通路对内皮祖细胞增殖的调控作用方法，其特征在于：所述S24中的①将各组细胞以细胞密度为2,000个/孔细胞置于96孔板中，每隔24h更换一次培养基(10％CCK-8溶液)，分别取5个时间点(0h，24h，48h，72h，96h)，每个时间点设置3次重复，使用酶标仪检测490nm双波长的OD值。
10.根据权利要求1所述的miRNA-296-5p通过ACE2信号通路对内皮祖细胞增殖的调控作用方法，其特征在于：所述S4中采用SPSS20.0统计软件对所得数据进行分析；定量资料用均数±标准差表示，分类变量用百分数表示，定量资料满足正态分布并且方差齐的两组组间比较采用t检验，多组比较采用方差分析；分类变量的多组比较采用Pearson卡方检验或Fisher确切概率法；应用ROC曲线进行敏感度和特异性分析；P＜0.05为差异有统计学意义。
...【技术特征摘要】
1.mirna-296-5p通过ace2信号通路对内皮祖细胞增殖的调控作用方法，其特征在于：包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的mirna-296-5p通过ace2信号通路对内皮祖细胞增殖的调控作用方法，其特征在于：所述s11中选取收治的高血压并发急性脑卒中患者(研究组)和在我院的同期健康体检者(对照组)作为研究对象。
3.根据权利要求1所述的mirna-296-5p通过ace2信号通路对内皮祖细胞增殖的调控作用方法，其特征在于：所述s12中独立样本计算公式公式中n为所需样本例数，s为总体标准差的估计值，一般假设其相等或者取合并方差的平方根，δ为两均数之差值，tα/2和tβ/2分别为检查水准α和第ⅱ型错误概率β所对应的t值，双侧α＝0.05，β＝0.1，查表得tα/2＝1.96，tβ/2＝1.282，前期预实验δ＝5.4，s＝8.78，带入公式经计算，n＝56。
4.根据权利要求1所述的mirna-296-5p通过ace2信号通路对内皮祖细胞增殖的调控作用方法，其特征在于：所述qrt-pcr法检测的反应条件：75℃预变性，2min，进入以下循环90℃变性，5min；60℃退火，60s；72℃延伸，30s；共40个循环，相对表达量用2-δδct表示，每组实验设置3次重复。
5.根据权利要求1所述的mirna-296-5p通过ace2信号通路对内皮祖细胞增殖的调控作用方法，其特征在于：所述westernblot法的检测步骤：首先收集各组细胞，pbs清洗3次后，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行裂解提取总蛋白，等量蛋白进行sds-page凝胶电泳分离后转至pvdf膜；然后用5％的bsa进行封闭，再依次孵育相应的一抗和二抗；最后进行显色并统计灰度值计算相对表达量。
6.根据权利要求1所述的mirna-296-5p通过ace2信号通路对内皮祖细胞增殖的调控...
【专利技术属性】
技术研发人员：李吉博，李丽萍，
申请(专利权)人：中国科学院大学深圳医院光明，
类型：发明
国别省市：
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